[研究目的和意义]肝纤维增生性疾病这一概念是著名肝病学家Hans Popper在1984年提出的,现已知肝纤维化是一组临床病理综合征,多种机体内外致病因素作用下,均可导致异常和过量的细胞外基质增生并沉积,其病理改变是以胶原为主的过度沉积,引起血管受压微循环灌注减少,进一步发展可引起门静脉高压和肝细胞脂肪变性坏死,最后成为不可逆转的硬化。因此,肝纤维化是各类肝实质损害转向肝硬化共同而基本的环节。随着对肝纤维化机制研究的深入,目前有学者研究证实部分肝纤维化或早期肝硬化是可逆的,因此对肝纤维化进行早期诊断、分期有着非常重要的意义。肝穿刺活检被认为是诊断肝纤维化的“金标准”,通过对肝脏活检标本连续性切片、染色可以判断出肝脏小叶结构、炎症范围、纤维化程度等改变。但该检查是一项侵袭性有创检查,只能对肝纤维化进行大致的静态评估,难以反复进行以评价纤维化进展和对治疗的反应,另外该技术不可避免存在穿刺标本的抽样误差、观察者之间的差异,使得越来越多的学者开始质疑其准确性及临床实用价值。寻求可反复使用的无创性方法来评价肝纤维化程度一直是近年来研究的热点、难点。超声、CT、MRI等影像学技术一直是无创性评价肝纤维化的重要手段,近年来开展的CT、MRI功能成像、弹性成像等逐渐成为研究的热点。常规的超声、CT和MRI可以显示肝脏的形态改变,但是对早期肝纤维化诊断不敏感,也不能对纤维化程度进行准确分级。超声造影比单纯的多普勒超声能更好的观察肝纤维化导致的血管结构扭曲和相关血流动力学改变,对纤维化程度进行分级,不过在超声血流动力学指标的选择及定量数值上尚无共识。灌注成像可在肝脏微循环水平上反映器官、组织的血供和血流动力学状态。目前较多的研究认为,肝纤维化门静脉灌注的减少和肝动脉灌注的增加可以鉴别轻度纤维化和中度纤维化。然而灌注成像研究的只是肝脏的某个层面,不能对全肝作全面研究,且灌注成像量化的数学模型也没有统一标准,不同的灌注模型所得的结果存在较大差异,另外灌注成像在扫描上受患者影响因素(呼吸运动、肝淤血、炎症等)较多,并且CT灌注具有一定的辐射性,而MRI灌注扫描成像较慢。弹性成像(Elastography)是利用肝脏组织受外源振动后的弹性变化来推测肝纤维化的程度,其成像结果与组织学分期有较好的相关性,但弹性成像测量的是纤维化造成的肝脏硬度的改变,而不是纤维化本身,因此其他引起肝脏硬度改变的非肝纤维化疾病(心力衰竭、急性炎症、门静脉高压、肝淤血、胆汁淤积等)均可以对结果产生较大影响。另外超声弹性成像还受肥胖、腹腔积液等因素的影响。利用磁共振扩散加权成像(DWI)诊断肝纤维化的研究开展较多,目前大多数研究认为肝纤维化由于纤维结缔组织的增加和血流量的减少,导致表观弥散系数(ADC)下降,其ADC值与纤维化程度存在显著相关性；然而对于扫描参数的选择和b值的选择尚无统一结论,并且DWI也存在较明显的局限性,诸如铁质沉积、脂肪变性等因素均会影响其结果的准确性。最近有学者提出标准化ADC值的概念,即ADC肝／ADC脾,认为标准化ADC值能更准确反映肝纤维化程度,且重复性更好,然而其临床应用价值尚需进一步证实。磁共振波谱成像(MRS)也是常用的肝纤维化分级研究方法,临床上常用1H波谱和31P波谱。到目前为止,众多的研究结论认为MRS可能是肝纤维化分级的潜在工具,对于波谱结果与病理改变之间的关系仍存有较多争论。MR分子影像学是一个新的研究热点,目前肝纤维化的MR分子影像尚处于动物实验阶段,寻找肝纤维化时高度表达的特异性分子将有利于提供显像的靶向性。其它MRI技术如磁化传递(MT)、弥散张量成像(DTI)、T, p-MRI成像等应用于肝纤维化分级的研究亦有文献报道,但限于样本数量等因素,其价值尚不明确。一般认为,肝脏从组织学上有3种间隙存在,即血管腔内间隙(intravascularspace,IVS)、细胞内间隙(intracellular space, ICS)、细胞外血管外间隙(extravascularextracellular space, EES)。肝纤维化的实质是胶原和基质蛋白沉积导致EES的膨胀,正常人EES约占总肝脏液性空间的15%,但是在肝纤维化患者中EES所占比例可以超过50%。Varenika等学者采用CCl4建立大鼠肝纤维化模型并进行对比剂增强CT扫描,通过肝实质强化程度相对血池强化程度的比值推算出肝细胞外间隙大小(extracellular space,ECS,由EES及IVS共同组成),其研究结果显示ECS大小与肝纤维化Ishak分级具有明显的正相关性(R 2=0.751,P<0.01),因此采用这种方法可以对肝纤维化大鼠模型中肝纤维化的程度进行定量评估。随后,Zissen等人也通过一组临床病例证实传统的水溶性碘对比剂经静脉注入一段时间后能够在EES和IVS之间达到平衡分布而不被肝细胞摄取进入IVS,即肝脏CT增强扫描的“平衡期”,此期肝实质强化的程度能间接反映对比剂在肝细胞外间隙(包括IVS及EES)的分布；从而对早期肝纤维做出评估。研究显示正常人的fECS约占总共液性空间的15%,而在肝硬化患者中可以超过50%。本文尝试在上述动物实验研究的基础上进行进一步的临床研究,利用传统水溶性碘对比剂能够在肝细胞外血管外间隙及血管内间隙达到平衡而不进入肝细胞内间隙的原理,采用螺旋CT增强扫描技术,通过肝实质强化程度相对血池强化程度的比值推算出肝细胞外间隙大小(包括血管外肝细胞外间隙及血管内间隙),从而对肝纤维化进行早期诊断及定量评估。研究的目的主要有：1、证实该测量方法是可行和有效的。2、证实正常人群及肝纤维化患者人群的肝细胞外间隙确实存在差异性。3、进一步完善和细化该测量的方法及具体步骤。本研究的主要意义在于通过这种简单、可重复、无创性的检查方法对肝纤维化进行定量评估、分期并做出早期临床诊断,为临床对肝纤维的早期治疗、评价疗效及预后提供客观的影像学依据；特别是对于我国的广大乙肝病毒携带者或感染者,这种简单、实用的检查方法可以起到早期筛查的目的,对于阻止或延缓肝硬化的发生有着重要的意义。[材料与方法]1.资料与方法1.1研究对象：选取因接受尿路造影检查的32例成年患者(既往无肝脏疾病病史)以及32例肝纤维化的患者。所有患者均无明显脂肪肝,无肝内胆管扩张,无肝脏肿瘤病史,未接受过肝脏手术、局部放疗或全身性的化疗,无血液系统疾病。肝纤维化组病例选取应包括慢性乙肝病史5年以上,同时具有血清学肝功能检查的异常。所有患者的选择均符合医学伦理委员会要求,签署知情同意书。1.2 CT检查：采用PHILIPS64排Brilliance螺旋CT扫描仪。常规扫描管电压选择120kV,管电流均为200-300mAs,管电流的控制采用飞利浦动态剂量调剂技术(Dynamic Dose Modulation, DOM)自动调节球管电流,在较厚部位增加信号,在较薄或含气部位减小信号。在同一圈旋转的过程中,根据患者同一部位不同投射角度吸收率的变化,实时动态调节射线剂量。其它扫描条件各组均相同(体位：上肢动脉根据病情选择患者最舒适的体位,下肢动脉最好取双手置于头部的仰卧位)。准直器组合：64×0.625mm;扫描视野：350mm;层厚：0.75-2mm,重建间隔：0.5-1mm；螺距：0.65。采集图像后传输至Extended Brilliance Workspace工作站进行后处理重建,层厚5mm,层距5mm。对比剂采用欧乃派克350mgI/ml,总量80ml,注射速率3ml/s。注射对比剂后25s、60s、10分钟行增强扫描。1.3肝脏穿刺活检：在B超引导下经皮肝脏穿刺,穿刺部位一般在腋前线第8、9肋间或腋中线第9、10肋间,采用击发式弹簧组织活检针,取肝组织2条,长1.5 cm,放入10%中性甲醛固定液中,石蜡包埋,组织3-4μm厚连续切片6张,要求观察到6个汇管区。切片染色：①常规染色：苏木素-伊红(HE)染色；Masson染色；网状纤维染色;D-PAS染色。②免疫组织化学染色：CK7; CK19;热休克蛋白(泛素)；免疫荧光：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)。1.4图像分析与数据处理：1.4.1定量分析分别由两名高年资医师对平扫及延迟增强扫描图像进行测量,测量结果有差异时,取两者的平均值。①肝实质强化程度(L)的测量：肝左右叶各选取两个圆形感兴趣区(region of interest,ROI,约l00mm2)测量其增强前后肝脏CT值,L=Lpost-Lpre。感兴趣区的选取应避开肝内主要血管及胆管的分布区(主要依据60S扫描时观察主要血管的分布区)；Area大小一致。②血池强化程度的测量：腹主动脉不同的三个层面测量其增强前后的CT值,ROI同前,A=Apost-Apre。③肝细胞外间隙(fECS)的评估：fECS=L/A×(1-Hct),Hct为红细胞压积。1.4.2统计分析所有数据采用SPSS18.0统计软件包处理,计数资料采用卡方检验、正态分布方差,其计量资料采用两独立样本t检验,以病理诊断作为“金标准”,通过绘制ROC曲线评价fECS对肝纤维化的诊断价值。取α=0.05的统计学检验水准。[结果与讨论]2.1肝纤维化组的病理分期及镜下表现(分期标准参照《慢性乙型肝炎防治指南》2010版)S1期8例：包括汇管区、汇管区周围纤维化和限局窦周纤维化或小叶内纤维瘢痕,二者均不影响小叶结构的完整性。S2期8例：桥接纤维化,虽有纤维间隔形成,但小叶结构大部分仍保留。S3期10例：可见大量纤维间隔,分隔并破坏肝小叶,致小叶结构紊乱,但尚无肝硬化。S4期6例：肝实质广泛破坏,弥漫性纤维增生,被分隔的肝细胞团呈不同程度的再生及假小叶形成。2.2正常组及不同病理分期的肝纤维化患者的肝细胞外间隙参数。本研究通过正常组和肝纤维化组病例两组数据的对比研究,发现与Zissen等人的研究结果类似。正常组fECS为0.298±0.056,肝纤维化组fECS为0.369±0.059,两组数据间采用t检验,P值<0.05,从而证实了正常组和肝纤维化组的肝细胞外间隙的大小存在着差异性。同时,参照病理等级分级标准,对所得数据进行ROC曲线分析,发现fECS=0.308作为对照组和纤维化组可能的切割点,当fECS>0.308时,则提示有可能已经发生了肝纤维化。Zissen等人在肝纤维患者的筛选过程中,纳入的标准是参照临床的MELD积分,该积分使用的血清肌酐、胆红素、INR等指标,容易受非肝病因素的影响,直接影响判断真实的肝纤维化的严重程度,在准确性上与病理结果存在较大的差异性。并且该积分往往用于终末期肝病的评估,对于早期肝纤维化并不敏感。本次研究肝纤维化组纳入的标准是采用穿刺活检病理结果的“金标准”,采集到的数据更为准确,结果也应更有参考价值。当然,在本研究选取病例的过程中,也需要排除肝脏脂肪沉积、肝内胆道扩张、肾排泄功能不全及贫血等多种因素的影响。对照病理分级结果,现有的32例肝纤维化患者(S1期8例,S2期8例,S3期10例,S4期6例)相对应的xfECS分别为0.311,0.322,0.326,0.395,各病理分级对应的fECS均数存在阶梯式的差异性；但由于受样本数的限制,该组数值受个体因素的影响仍较大,可能存在较大误差；在接下来的研究中,在丰富病例数据的基础上,我们将进一步探讨肝纤维化患者fECS大小与病理分级之间的关系,力求找出早、中、晚期肝纤维化的分界值。[结论]螺旋CT增强延迟扫描能够对肝细胞外间隙(fECS)的大小进行定量评估,通过对照病理分级结果,fECS能够较准确预示肝纤维化的严重程度。