目的:近年来伴随着多种微生物污染问题的爆发,广义的生物安全问题逐渐成为了研究热点。水与空气资源作为微生物污染的主要传播媒介,其广泛的分布以及无可替代的重要程度时刻提醒我们要重视对资源状况的监控与保护。细菌总数作为水中微生物含量的重要指标之一,能够直观的反映水体受污染的程度,因此在许多水质检测标准中均规定将细菌总数作为一项必要的检测项目。在日常生活工作中建立快速准确的水体样本细菌检测方法对生活用水、科研实验、医疗卫生、精密加工质量控制以及水资源的监控与保护,甚至是生物恐怖活动的防治都具有十分重要的意义。目前在该领域应用最多的仍是传统的检测方法,尤其以平板培养法为各国检测的标准方法,新的检测方法的提出为水体细菌的检测提供了许多更快速、更准确的研究思路,但是总体来说这些方法仍处于研究阶段。本文所述课题旨在课题组研究的基础上,进一步掌握单粒子检测技术并将其应用于水体细菌总数的检测。在系统样机研制的过程中积累经验,助力于单粒子检测技术在水体样本检测专项应用方面的推广,为单粒子检测技术的应用提供新的思路。方法和内容:通过对现有的流式检测原理进行剖析,在国外已有的检测技术和相关装备的基础上,提出单粒子水体总菌检测系统关键技术研究和实验装置的研制。主要研究内容及方法包括:I.样本前处理方法研究;通过查阅文献及实验验证,对不同原理的前处理方法进行探索,对比不同染料、不同碳点对细菌的染色效果,确立课题所使用的染色方案在该检测原理下的可行性与准确性;通过前处理方案的确定,为光路系统光源选择、探测通道镜片参数制定提供必要的设计参数。II.光学模块设计与参数优化;将光路模块从总体上分为激发光路与检测光路两部分,通过理论仿真分析,设计激光光路实现对原始光斑的整形从而得到理想的检测光斑;设计检测光路对荧光信号进行选择性接收;在课题中对该系统的光源选择、镜片参数、光路结构三个方面进行系统性优化,并依据前处理方案拟定的染料特性对检测光路参数进行优化处理。III.液流模块设计与参数优化;通过不同设计方案对比,使用不同动力源控制样本液和鞘液,使其在检测区形成由外部鞘液流包裹内部样本液流的同轴流动模式,通过对液流系统效果进行评价分析,优化设计方案与控制参数。课题通过实验探索,确定了具有较高安全性的进样液路及整体流路方案。IV.信号处理模块设计与优化;系统在检测区由激发光斑激发染色后的细菌,经过检测光路对荧光信号进行探测收集,通过光电倍增管将光信号转换为电信号,再经过放大、滤波、AD转换后成为数字信号传递给FPGA主控芯片。课题中针对系统的信号特点进行了相关电路设计及参数优化,绘制PCB板并完成电路系统调试。V.峰值处理算法的提出以及验证;对微米级待测样本粒子经荧光染色后荧光信号强度分布进行建模仿真,探寻待测样本荧光信号的特征,结合系统检测平台的检测需求设计具有针对性的信号处理方法,在Verilog语言环境下实现算法的应用并通过实验验证算法的准确性及稳定性,对算法进行优化。VI.系统结构设计与优化;在系统搭建初期,采用独立的分模块构建方案,将总体系统划分为几个子系统模块,在逐步实现各个模块的拟定功能后,为了提高系统集成度,在控制系统采用以FPGA为核心的控制方案,在硬件电路中围绕FPGA为核心分别构建中心电源板、信号处理板、信号控制板以及微控板为主体的4块直插式电路控制系统,将各独立模块综合集成为一体,优化系统结构。结果:I.光路系统采用设计方案后激光器原始光斑大小约为844*765um,椭圆度约为0.906,经过XY双轴整形透镜组整形后,在检测点位置光斑大小77.8*19.8um,在焦点位置附近光斑变化趋势较小,具有较好的稳定性。II.液流系统分别采用柱塞泵与气压泵作为动力源,解决了样本“死体积”问题引入的污染,避免了“脉动”问题带来的样本回流现象;使样品进样不受样本管体积限制,实现连续检测;大约0.4s即可在鞘液液瓶中建立稳定的气压,电压值约为1.1v,稳定效果较好。III.峰值处理算法重复检测10组样本相对标准偏差为5.36%,并且仅需3个参数即可实现系统信号的快速处理,与现有检测方法相比具有较好的一致性,可满足系统的检测需求。IV.整体系统微球测试表明当进样速度处于0.5ul/s-1ul/s之间时,样本检测结果间差异较小,检测过程更稳定;针对不同浓度样本检测CV值均在2-3.5之间,达到了较好的检测精度。V.系统整体测试人工添加金黄色葡萄球菌10倍梯度浓度结果表明,目前系统最佳检测限为103-106cfu/ml浓度范围,在该检测限内与平皿计数法检测结果具有较好的一致性,在低于该检测限时检测结果明显高于平皿计数法;与现有流式细胞仪的统计结果始终保持较好的一致性。总结与展望:I.在现有样机的基础上,通过对子系统各部分分别优化,进一步提高整体系统的检测灵敏度。II.增加荧光收集通道,在理论上通过该样本前处理方法,可实现对水体细菌总数中死菌与活菌数量分别检测,通过增加检测通道,提高系统单次检测的分析能力。III.优化峰值检测算法,进一步提升算法的灵敏度以及多平台的通用性,提高算法的自适应分析能力。IV.对现有系统结构进行优化,提升系统的集成度与便携性。