研究背景:马尔尼菲蓝状菌（Talaromyces marneffei,TM）感染好发于免疫力低下人群,尤其是AIDS患者。基于AIDS患者居高不下的现状以及近年来免疫抑制剂的广泛使用,TM感染率呈逐年上升的趋势。TM感染患者临床表现不典型,其症状包括发热、肝脾肿大、溶骨损害和皮肤破损等,感染后期更会出现严重的TM全身播散性感染,这也是造成TM感染死亡的主要原因。因此揭示TM致病机制,推进TM诊疗进程显得尤为迫切。目前虽有部分研究证实黑色素、过氧化物酶和MP1等是TM重要致病因子,但其具体致病机制仍不明确。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）是大多数有机生命体释放的双层脂质纳米结构,大小为100-1000nm,包含功能学蛋白、核酸和脂质,可作用于靶细胞发挥多种生物学效应。目前有多种真菌已被证实可以分泌具有生物活性的EVs,参与后续免疫反应,但目前尚未有关于TM-EVs的研究报道。我们的课题主要立足于TM-EVs,另辟蹊径,研究其与免疫细胞的相互作用,进一步探索TM致病机制,为临床诊疗提供新视点。研究内容和方法:首先体外提取并通过密度梯度纯化TM培养上清液中的EVs,分别用电镜（TEM）和纳米颗粒分析仪（NTA）对TM-EVs进行形态和粒径表征。基于荧光共定位实验建立TM-EVs与小鼠巨噬细胞共孵育模型,研究TM-EVs对小鼠巨噬细胞的炎症刺激作用。通过酶解实验逐个破坏TM-EVs成分,观察其水解前后刺激小鼠巨噬细胞炎症变化情况,从而明确TM-EVs主要致炎成分。最后经蛋白组学分析TM-EVs刺激前后小鼠巨噬细胞的蛋白表达差异,初步探讨TM-EVs致炎机制。研究结果:体外实验证实TM-EVs主要位于20%密度区间,平均直径大致为170 nm,呈典型的“杯状”双层脂质结构,同时体内实验也证实了 TM-EVs的存在。荧光共定位实验表明小鼠巨噬细胞可以主动吞噬DiI标记的TM-EVs,且主要依赖于肌动蛋白。实验结果显示TM-EVs不仅可以显著促进小鼠巨噬细胞活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）的产生,还可以提升其分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子的水平。此外,TM-EVs还可增强小鼠巨噬细胞的抗原呈递能力。酶解实验表明TM-EVs主要通过蛋白发挥炎性刺激效应,TM-EVs蛋白组学也揭示了其含有多种毒力因子。差异蛋白组学分析结果表明TM-EVs刺激巨噬细胞后,其上调蛋白主要富集在NF-κB相关通路上,qPCR实验证实其NF-κB p65的mRNA水平显著上升,p65和IκBα磷酸化水平显著上升。NF-κB活化抑制剂BAY 11-7082则可显著抑制TM-EVs致炎作用。此外,通过siRNA干扰实验初步猜测TM-EVs部分依赖于TLRs受体发挥致炎作用。研究结论:本研究结果表明TM-EVs可活化小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症状态,并初步证实TM-EVs主要通过TLRs和NF-κB发挥致炎效应。