【摘 要】
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目的:前期研究发现,蛋白磷酸酶5(Protein Phosphatase 5,PP5)能够直接调节抑癌基因p53的去磷酸化。对基因敲除小鼠和体外细胞的研究发现,抑制PP5可明显增加p53的活性和表达,增加PP5的表达可在蛋白质水平抑制p53的活性。同时这种作用是相互的,p53也可以调控PP5的表达,这提示PP5与肿瘤的发生和癌变可能存在相关性。本论文通过构建PP5转基因小鼠(以下称Tg-hPP5)
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目的:前期研究发现,蛋白磷酸酶5(Protein Phosphatase 5,PP5)能够直接调节抑癌基因p53的去磷酸化。对基因敲除小鼠和体外细胞的研究发现,抑制PP5可明显增加p53的活性和表达,增加PP5的表达可在蛋白质水平抑制p53的活性。同时这种作用是相互的,p53也可以调控PP5的表达,这提示PP5与肿瘤的发生和癌变可能存在相关性。本论文通过构建PP5转基因小鼠(以下称Tg-hPP5)并观察转基因小鼠的生长发育情况及致瘤能力,来探索转基因小鼠中的PP5在发育和肿瘤发生中的作用。方法:1.构建组成型表达人PP5(hPP5)的表达载体,并通过基因工程技术手段获得PP5转基因小鼠,利用PCR方法鉴定阳性转基因小鼠,通过分子生物学手段鉴定hPP5的转录水平和蛋白质翻译水平;2.通过观察hPP5转基因小鼠和野生小鼠的发育情况,来研究PP5在小鼠生长发育中发挥的作用;3.通过组织mRNA水平的Real-time PCR检测、蛋白质水平的Western Blot检测和病理学染色的方法,对小鼠角膜中p53、Phos-p53进行定量和定性研究;4.通过Real-time PCR检测方法结合病理学手段,检验小鼠角膜上皮细胞中p53和下游基因以及增殖相关的成纤维细胞生长因子7(FGF-7)的变化趋势;5.设计双萤光素酶报告基因检测实验,探究PP5对FGF-7转录的调节。结果:1.利用针对转基因载体的特异引物结合PCR方法,鉴定获得过表达hPP5的转基因小鼠,分子生物学结果显示hPP5能够在转基因小鼠体内高表达。Tg-hPP5小鼠可以表现出正常的发育状态,并可以进行有性繁殖;2.在4月龄Tg-hPP5小鼠中发现角膜鳞状上皮细胞过度增殖,随时间的推移侵犯角膜基质层;3.Tg-hPP5小鼠角膜和其他组织中总p53和Phos-p53的蛋白质表达量明显降低,表明过表达PP5基因可减弱小鼠体内p53的功能,使得其识别并修复DNA损伤的能力下降;4.Tg-hPP5小鼠角膜增生表型的组织中可检测到显著增加的成纤维细胞生长因子7(FGF-7)的表达;5.通过双萤光素酶报告基因检测和生物信息学分析发现PP5能够促进FGF-7的转录。结论:过表达PP5的Tg-hPP5小鼠角膜增生病变是上皮细胞的增殖引起的,随月龄增加可能发展为角膜鳞状上皮癌。上皮增生起源于抑癌基因p53表达产物功能的减弱,降低其识别和修复DNA损伤的能力,并间接增强FGF-7的表达。本研究为角膜增生病变的发生学研究提供新的见解和思路,并为肿瘤研究提供新的方向。
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