心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)是心肌梗死诊断的“金标准”,临床多采用大型免疫分析仪器检测,灵敏度可达到10pg/mL级别,但缺点是对操作人员专业性要求高、仪器购买和维护成本高。侧向免疫层析技术在心肌标志物检测方面已得到广泛应用,具有操作简单、反应快速、仪器便携等优点,但发展受到了灵敏度的制约。研究者通过金染/银染信号放大胶体金光学信号、更高灵敏度的磁信号代替光学信号、引入功能性核酸/蛋白的方法提高检测灵敏度,但又带来其他问题,如背景升高、耗时长、对材料要求高、成本高等。纳米探针的构建方式常常决定层析检测的效果。探针上抗体的数量、取向、免疫活性以及与载体结合的牢固程度则是影响探针功能的关键因素。本文针对这些关键问题,从灵敏、准确、快速、降低成本、易于批量制备等几方面入手,着眼于抗体在微球表面的修饰技术,建立了几种新型荧光定量纳米探针的制备方法,并应用于心肌标志物的检测研究。主要工作如下:1)链霉亲和素-生物素介导的信号放大法。本部分利用微球作为基底,生物素-核心链霉亲和素-生物素-抗体层层结合,最大限度增加了荧光分子和抗体分子在探针上的负载量,可显著提高检测灵敏度和特异性。cTnⅠ最低检出限达到0.049ng/mL,批内差和批间差都低于10%,线性拟合R值大于0.99,储存稳定性好。抗人血清样本中杂质干扰能力强,与临床化学发光免疫分析系统检测结果一致性好(R值大于0.99)。2)蛋白G取向抗体及小分子交联剂强化固定法的建立。蛋白A或蛋白G对抗体Fc端具有强大的靶向能力,但这种结合可逆,且结合强度与抗体来源、亚型相关。本部分制备了一种基于蛋白G的抗体取向修饰的荧光微球探针,抗体的Fc端被微球载体表面修饰的蛋白G捕获后,被小分子共价交联剂牢牢固定在蛋白G层上,最终使抗体高效、取向、牢固地结合到载体上。本文首次使用异嗜性抗体阻断剂作为蛋白G的封闭剂,改善了检测的特异性。将该探针应用于侧向免疫层析检测cTnⅠ,最低检出限为0.032ng/mL,线性拟合的R值大于0.99,变异系数小于10%,与临床数据一致性高(R值大于0.99),并在热加速实验中表现出良好的稳定性。3)pH调控抗体取向化学偶联法的建立和机理分析。化学偶联法被广泛应用于蛋白质和纳米材料的结合,以其通用性强、操作简单广受青睐。但化学偶联几乎不加选择地占用了抗体上的活性氨基基团,使抗体方向随机地结合到基质上,容易导致其抗原结合区域与基质表面接触,抗原结合位点无法充分暴露而丧失活性。此外,如果被占用的基团恰好处于抗原结合位点附近,由于空间位阻的存在,抗体同样会丧失免疫活性。抗体的电荷分布和亲疏水性在不同pH下具有不同的表现,基于此,本部分我们通过设置抗体结合到微球上的最佳反应pH,发展了一种简单的抗体取向方法并用于侧向层析检测。抗体的结合效率、取向以及检测灵敏度都得到了显著提高。偶联pH从7.8降到5.8后,抗体结合效率提高30%,探针表面抗体Fc端暴露程度降低60%,检测信号强度增加4倍。尽管pH调节是抗体偶联实验中常用的优化手段,但本文首次阐述了其增强抗体取向的机理,并揭示了抗体的密度、电荷分布和亲疏水性,以及物理吸附和化学偶联速度的控制等对抗体取向的重要影响。综上,本研究发展的新型探针制备方法操作简单,通用性强,适用于各种抗体,在疾病、环境、食品等领域标志物的检测中具有很大的应用潜力。