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本研究以野生型B6(TLR2+/+)小鼠及Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)2敲除B6(TLR2-/-)小鼠为研究对象,通过乳导管灌注乳房链球菌(Streptococcus ubeis.,S.ubeS.)及原代小鼠乳腺上皮细胞(Mice mammary epithelial cell,MMEC)与&ube S.共孵育建立体内、体外乳腺炎症研究模型,深入探讨了 TLR2缺失对&ubeS.引起的乳腺炎症造成的影响,揭示了 TLR2在S.uberis感染中的作用。结果如下:1 TLR2在S.uberis引起的小鼠乳腺局部炎症中的作用本研究以TLR2+/+小鼠和TLR2-/-小鼠为研究对象,在小鼠分娩72h后,乳腺灌注S.uberis(设生理盐水灌注对照),24 h后无菌条件采集乳腺组织。首先,从病理学角度观察乳腺灌注S.uberis后两种小鼠乳腺组织形态学变化及差异;在此基础上NN-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NN-Acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase)与诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性与S.uberis载菌量;然后,利用免疫组织化学技术分析S.ubris感染乳腺后对乳腺组织中TLR2介导的信号通路蛋白的激活的影响,最后,检测乳腺中细胞因子的分泌与抗氧化能力相关指标。研究发现:S uberis在两种小鼠中均能引起明显的炎症反应,且TLR2-/-小鼠中的出血坏死、脂肪组织增生程度显著大于TLR2+/+小鼠(P<0.05)。经乳腺灌注S.uberis后,TLR2-/-小鼠乳腺组织中S.uberis.浓度显著高于TLR2+/+小鼠乳腺中细菌浓度;TLR2+/+与TLR2-/+小鼠乳腺组织中NAGase与iNOS的活性均显著提高(P<0.05),但两者在TLR2+/+小鼠乳腺中酶活性显著低于TLR2-/-小鼠(P<0.05);TLR2+/+小鼠中TLR2介导的通路蛋白表达被激活,包括髓-样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)、转化生长因子激酶 1(Transforminggrowth factor β-activated kinase 1,TAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子 6(Tumor necrosis factor receptor associated factor,TRAF6)、Toll 途径进化保守信号介导因子(Evolutionarily conserved signaling intermediate toll pathways,ECSIT),而 TLR2-/-小鼠中 MyD88、TAK1、TRAF6、TRIF 表达上调,但MyD88、TAK1表达显著低于野生小鼠(P<0.05);TLR2-/-小鼠中肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、(C-X-C motif chemokine ligand,CXCL)15 分泌显著增加(P<0.05),TLR2+/+小鼠中 TNF-α、IL-1β、CXCL15分泌显著增加,其中IL-1 β含量显著高于TLR2-/-小鼠(P<0.05);TLR2+/+小鼠和TLR2-/-小鼠乳腺组织中总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)下降,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)显著上升(P<0.05),而TLR2-/-小鼠超氧化物歧化酶(Superoxidedismutases,SOD)活性显著降低(P<0.05)。结果表明:Suberis引起TLR2敲除小鼠更为严重的炎症反应与组织损伤,且TLR2-/-、鼠对S.uberis清除能力有所下降,同时S.ubeS.能够激活TLR2+/+小鼠与TLR2-/-小鼠中TLR2信号通路蛋白及其介导的细胞因子的释放,而在TLR2-/-小鼠中对TLR2信号蛋白的激活有所下降(P<0.05),且细胞因子与野生小鼠中存在些许差异。Suberis感染在TLR2+/+小鼠与TLR2-/-小鼠中均能够引起抗氧化能力变化。2 TLR2+/+与TLR2—/-小鼠乳腺灌注S.uberis后血浆中抗氧化能力及细胞因子水平的比较为探讨TLR2在S.uberis感染小鼠乳腺后对血浆中抗氧化能力及细胞因子产生的影响,本研究以野生型B6小鼠(TLR2+/+)和TLR2敲除B6小鼠(TLR2-/—)为研究对象,在小鼠分娩72 h时,乳腺灌注S.uberis(设生理盐水灌注对照),24 h后采集血液并制备血浆。实验结果表明:TLR2+/+小鼠血浆中T-AOC显著高于TLR2-/-小鼠,乳房灌注S.uberis后TLR2+/+及TLR2-/-小鼠血浆中T-AOC水平均显著降低,同对照组相比差异显著(P<0.05),且野生型中也显著高于TLR2—/-型;SOD活力在TLR2-/-小鼠中无变化,而在野生小鼠中显著降低,MDA含量在两种小鼠中均显著升高,野生型小鼠中含量低于敲除小鼠(PP<0.05);TLR2-/-小鼠在S.uberis感染后血浆中TNF-α分泌显著增加(P<0.05);野生型小鼠在感染后IL-6分泌显著增加(P<0.05);研究表明:TLR2参与了 S.uberis诱发乳腺局部炎症后的机体整体水平的抗氧化能力及细胞因子分泌的变化,但不是唯一因素。3原代小鼠乳腺上皮细胞中TLR2抗S.uberis.感染机制的研究之前在体实验已经探究了 TLR2与S.uberis感染引起的局部与总体炎症之间的关系,为了进一步了解TLR2在炎症反应过程中的调节机制,将妊娠15-18 d的TLR2+/+与TLR2-/-小鼠处死,无菌收集乳腺组织,用I型胶原酶、透明质酸酶和胰酶联合消化分离得到MMEC,待细胞铺满整个培养板的80%-90%时,与S.uberi 共孵育,分别于不同时间点收集上清与细胞。研究发现,S.uberis.刺激后,TLR2+/+与TLR2-/-MMEC呈现不同程度的细胞核皱缩,在5 h细胞出现死亡。对细胞中S.uberis载菌量测定发现,随着S.ube.孵育时间的增加,TLR2+/+ MMEC中S.ubeS.数目先降低后升高,而在TLR2-/-MMEC中持续升高,并且在各时间点均高于TLR2+/+细胞(P<0.05)。NAGase与iNOS活性检测结果显示,在S.uberis 感染乳腺上皮细胞后NAGase与iNOS酶活均显著升高,且TLR2-/-MMEC中NAGase(1h,3h)和iNOS(3h)活性显著高于 TLR2+/+MMEC(P<0.05)。细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产量先上升后降低,在2 h达到峰值,3 h开始下降,且在各时间点TLR2+/+MMEC的ROS产量均高于 TLR2-/-细胞;2 h 检测线粒体源 ROS(Mitochondrial reactive oxygen species,mROS)发现TLR2-/-MMEC中的mROS产量显著低于TLR2+/+ MMEC,且此时TLR2+/+MMEC中解偶联蛋白(Uncoupling protein,UCP)2活性显著低于TLR2-/-细胞(P<0.05);过氧化氢(hydrogen peroxide,H202)浓度升高,TLR2+/+MMEC 中 H2O2浓度(3 h)高于TLR2-/-细胞;T-AOC水平、SOD活性下降、MDA浓度升高,TLR2-/-MMEC中SOD 活性(1 h)高于 TLR2+/+细胞,MDA 浓度(1 h,3 h)低于 TLR2+/+细胞(P<0.05);S.uberis处理MMEC后引起细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、CXCL15的分泌增加,两种细胞中TNF-α、IL-6、CXCL15感染后表达显著升高,IL-1β在感染3 h分泌升高,TLR2-/-MMEC 中 TNF-α(1 h,3 h),IL-1β(3 h),IL-6(3 h)分泌水平低于 TLR2+/+细胞,而CXCL15分泌水平高于TLR2+/+MMEC(P<0.05)。以上结果表明,MMEC在应答S.ubeS.感染时,TLR2功能的丧失,使细胞损伤更为严重,细胞黏附效率更高,同时具有杀菌功能的ROS以及mROS在TLR2缺失时产生明显下降,抗氧化能力下降减弱,TLR2介导的细胞因子(除CXCL15)的产生降低。