1研究背景心肌梗死随着其发病率和致死率的逐年攀升,已成为严重威胁国民身体健康的第一杀手。急性期心肌梗死主要的死亡原因是急性心力衰竭,随着医疗水平的进步,内科药物溶栓、介入支架和外科的搭桥手术使急性期MI发展成急性心衰进而导致死亡的几率大幅度下降。但随着病情的进一步发展转为慢性期。慢性期主要以心脏纤维化重塑为主,如果纤维重塑过度会引起慢性心衰而导致死亡。有研究表明,单核/巨噬细胞系统包括循环中的单核细胞和定居于组织中的巨噬细胞,在MI炎症反应始动阶段到重塑阶段均发挥着重要的调控作用。在MI急性期,冠状动脉完全闭塞、组织缺氧导致心肌细胞坏死,释放大量趋化因子,以嗜中性粒细胞和M1型巨噬细胞为主的炎性细胞浸润到梗死区,释放大量MMPs降解梗死区域的细胞外基质(ECM),同时巨噬细胞吞噬坏死的心肌细胞。随后,这些炎性细胞释放细胞因子、生长因子和血管生成因子促进新生血管的生成。肌成纤维细胞和内皮细胞迁移并扩散到梗塞区,(肌)成纤维细胞活化分泌大量的ECM形成疤痕组织。后期巨噬细胞向抗炎的M2表型转化,后者抑制炎症反应,并通过与(肌)成纤维细胞相互作用对ECM进一步重塑,然而如果修复和重塑不良将会引起渐进的左室扩张和功能下降,最终导致慢性心衰。M1型巨噬细胞的长期存在会使炎症反应持续存在,炎性浸润范围扩大,后期心肌纤维化面积增大、受损心室壁重塑不良,最终导致心衰。及早的促使巨噬细胞表型从M1型向M2型转化,有助于及早缓解炎症反应,缩小炎性浸润范围和纤维化面积,改善心肌重构和心功能。因此促进巨噬细胞向M2型极化,及早缓解炎症反应,是MI后治疗的重要对策。胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)是近年来发现的一种新型细胞因子,最早发现于上皮细胞,在炎症条件下巨噬细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等也可分泌TSLP。TSLP通过与细胞表面TSLP受体(TSLP receptor,TSLPR)结合而发挥生物学效应。据报道,TSLP/TSLPR激活可诱导巨噬细胞向M2型极化,促进抗炎因子的产生。在本研究中,我们将探索TSLP在MI后巨噬细胞极化、心肌重构和心功能恢复中的作用。2研究目的2.1研究MI后TSLP的表达变化;2.2研究TSLP对MI后巨噬细胞极化、炎症反应和组织修复的作用;2.3研究TSLP对心功能恢复的影响。3研究方法3.1动物模型的建立8周龄C57小鼠(20-25g),分为对照组和MI手术组。适应性喂养一周后,MI手术组小鼠在2%异氟烷麻醉下,于胸骨左缘第4肋间开胸,将心脏挤出胸腔,用7.0号无损伤线结扎冠状动脉左前降支(LAD),结扎线以下小鼠心肌组织变白,室壁活动强度减弱,证明结扎成功。对照组小鼠,只穿线不结扎。MI手术组小鼠进一步分为单纯MI组、MI+TSLP重组蛋白组、MI+TSLP中和抗体组,术后每天皮下注射TSLP重组蛋白(rTSLP;600ng/250μl/只/天)或TSLP中和抗体(anti-TSLP;600ng/250μl/只/天)或相同体积的PBS。每组小鼠分三批,分别于第1、3、7天取材。3.2心脏功能的测定取材前,采用心脏二维超声及M超成像技术,通过测定左室收缩/舒张末期直径,左室射血分数及左室短轴缩短率评价小鼠心脏功能。3.3酶联免疫吸附法检测MI后1、3、7天小鼠血清中TSLP表达水平。3.4蛋白印迹MI后7天提取各组小鼠心脏组织蛋白,检测TSLP蛋白表达水平。3.5免疫荧光染色收集各组小鼠心脏,制备石蜡切片,免疫荧光双标标记心肌组织中CD86+Moma-2+和 CD206+Moma-2+细胞。3.6组织学染色HE染色用于评估心脏大体形态及心肌细胞直径的变化。Masson和天狼星红染色用于评价胶原沉积情况及计算心肌梗死面积。3.7统计学分析应用SPSS 18.0软件分析处理数据,并均数±标准差(Mean± S.E.M.)表示。4研究结果4.1 MI后小鼠体内TSLP的表达增加MI后1天小鼠血清中TSLP含量开始升高,3天、7天升高值具有统计学意义。Western blot结果表明,MI后7天心肌组织中TSLP蛋白表达较对照组明显升高。4.2 TSLP促进心肌组织中巨噬细胞向M2型极化免疫荧光双标结果显示,MI组心肌中,MI后1天有大量CD86+巨噬细胞,CD206+巨噬细胞数量很少;MI后3天CD86+巨噬细胞数量明显减低,CD206+巨噬细胞数量明显增加;MI后7天CD86+巨噬细胞进一步减少,CD206+巨噬细胞占主要优势。MI+rTSLP组心肌中,MI后1天CD86+巨噬细胞含量较MI组无明显变化,CD206+巨噬细胞较MI组增加。MI后3天,CD86+巨噬细胞含量较MI组明显降低,CD206+巨噬细胞明显增加占主要优势。MI后7天心肌中,CD206+巨噬细胞仍占明显优势,但CD86+、CD206+巨噬细胞含量均比MI后3天有所减少。在MI+anti-TSLP组心肌中,MI后1天、3天、7天CD86+巨噬细胞含量较MI组均有增加,而CD206+巨噬细胞含量较MI组减低。以上结果说明MI后TSLP表达上调,促进巨噬细胞向M2型转换。4.3 TSLP缓解MI区炎症反应,促进心肌早期修复取MI后1周心肌组织石蜡切片进行染色。HE染色发现,与MI组相比,MI+rTSLP组心肌梗死边缘区炎性浸润面积明显减小;而MI+anti-TSLP组梗死边缘区炎性浸润范围明显增大。Masson和天狼星红染色发现,与MI组相比,MI+rTSLP组梗死区心肌组织中胶原明显增多;而MI+anti-TSLP组梗死区胶原明显减少。说明MI后早期TSLP可以缓解炎症反应,促进心肌修复。4.4 rTSLP治疗可显著改善MI后早期心功能异常MI术后1周,取材前各组小鼠行心脏超声检测心功能。B超下MI组及MI+antiTSLP组小鼠,室间隔活动度明显减低,左室明显扩张;MI+rTSLP组小鼠室间隔活动度较好,左室扩张不明显。M超测量,相比于MI组,MI+rTSLP组小鼠左室射血分数(EF)及短轴缩短率(FS)明显升高,提示心脏收缩功能改善。此外,MI+rTSLP组小鼠舒张末左室体积(LVvold)较MI组明显减小,提示左室扩张程度有所减轻。上述结果表明,rTSLP治疗可以改善心肌重构,促进心功能恢复。5研究结论5.1 MI后心肌组织和血清中TSLP表达水平明显升高;5.2 MI后TSLP水平升高可促进巨噬细胞向M2型极化,抑制炎症反应,促进组织修复;5.3 rTSLP应用于MI后早期治疗可以改善心脏重构,有利于心功能恢复。1研究背景心肌梗死(myocardial infarction,MI)是心血管疾病中导致心衰的首要原因。心肌梗死是由于冠脉阻塞引起的,导致下游心肌血氧供应不足,引起心肌细胞凋亡坏死,单核巨噬细胞浸润,引发炎症反应和组织修复。如果不给予及时干预,心肌重构导致心肌过度纤维化,心肌电生理系统受损,左室负荷改变,导致左室功能失调最终导致心衰。因而,MI后心肌修复的质量决定其预后。巨噬细胞是一种可塑性很强的细胞,在不同的微环境的刺激下可以分化成不同表型,主要分为经典激活M1型和替代激活M2型。M1型巨噬细胞主要分泌促炎因子,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6),促进炎症反应。此外,M1型细胞还可分泌大量基质金属蛋白酶(MMPs),后者可以水解细胞外基质,参与MI后心肌重构。M2型巨噬细胞产生大量抗炎因子,如白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10),缓解炎症反应,促进组织修复。MI后大量外周单核细胞进入缺血的心肌组织,分化成M1型巨噬细胞来清除坏死和凋亡的细胞(这是1期炎症反应期)。而后进入2期炎症缓解期,巨噬细胞以M2型为主,参与心肌组织修复。近来研究表明,及早促使巨噬细胞从M1型向M2型转化,有助于改善心肌重构和心功能恢复。因此促进巨噬细胞向M2型极化,尽早缓解炎症反应,是MI后治疗的重要策略。胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)是近年来发现的一种新型细胞因子,结构类似于IL-7,最早发现于上皮细胞,在炎症条件下巨噬细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等也可分泌TSLP。在外界刺激的作用下,上述细胞合成及分泌TSLP,通过与细胞表面TSLP受体(thymic stromal lymphopoietin receptor,TSLPR)结合而发挥生物学效应。TSLPR为Ⅰ型跨膜蛋白,属于造血细胞因子受体家族。既往研究发现,TSLP通过诱导Th2型免疫应答在机体和外环境的联系中起着关键作用。在气道过敏性炎症中,TSLP与内源性IL-13/IL-4协同作用,诱导肺泡巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化,促进Th2型炎症反应;在经TSLP处理的小鼠体内,MR、Arg1和Ym1等M2型标志物表达水平明显减低。我们在体内研究中已证实TSLP在MI后小鼠血清和心肌组织中表达水平明显升高;且rTSLP应用于MI后早期可促进巨噬细胞M2型极化,抑制炎症反应、缩小心梗范围,促进胶原沉积和心功能恢复。然而,MI后TSLP促进巨噬细胞极化的作用及具体机制尚未在体外证实。MI 后肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)激活,其核心产物血管紧张素ⅡⅡ(angiotensinⅡ,Ang Ⅱ)在MI后心肌重构过程中发挥重要作用。Ang Ⅱ主要通过与AT1受体结合,以自分泌/旁分泌的方式促进心肌细胞的凋亡、肥大及心肌成纤维细胞增殖、迁移并促进细胞外基质的合成和分泌,进而导致心肌重塑。然而,AngⅡ对MI后心肌组织中巨噬细胞的作用目前尚未完全阐明。已有研究发现AngⅡ可促使平滑肌细胞分泌TSLP,而后者可诱导巨噬细胞极化并抑制炎症反应。在本研究中,我们拟用Ang刺激巨噬细胞模拟MI后心肌组织内环境,探索AngⅡ能否促进巨噬细胞分泌TSLP,以及TSLP在巨噬细胞极化和炎症反应中的作用。2研究目的2.1研究TSLP对巨噬细胞极化的作用;2.2研究AngⅡ对巨噬细胞分泌TSLP的作用;2.3研究AngⅡ能否通过TSLP调节巨噬细胞极化和炎症反应。3研究方法3.1细胞培养提取小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs),用含10%FBS和10 ng/mL小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的RPMI 1640培养BMDMs。3.2蛋白印迹收集各组细胞提取蛋白,分别检测TSLP,Arg1,iNos,MMP9,MMP2蛋白表达水平。3.3酶联免疫吸附法检测细胞上清TSLP,TNF-α,IL-6,IL-10及TGF-β水平;检测小鼠血清TSLP水平。3.4明胶酶谱法用明胶酶谱法检测各组BMDMs上清液中MMP2和MMP9的活性。3.5流式细胞术收集各组细胞,检测CD86,CD206细胞表型。3.6统计学分析应用SPSS18.0软件分析处理数据,并均数±标准差(Mean± S.E.M.)表示。4研究结果4.1 TSLP促进巨噬细胞向M2表型转换应用不同浓度的TSLP重组蛋白(rTSLP、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL)刺激BMDMs 72小时,Western blot检测发现,rTSLP可促进M2型标志物Arg1表达,抑制M1型标志物iNos及基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达,且其作用呈剂量依赖性。4.2 TSLP抑制炎症反应应用20ng/ml rTSLP刺激BMDMs 72小时。ELISA法检测结果发现,rTSLP促进抑炎因子(IL-10、TGF-β)的分泌,抑制促炎因子(TNF-α、IL-6)的分泌。明胶酶谱法检测发现,rTSLP明显抑制MM2和MMP9的活性。4.3 AngⅡ促进巨噬细胞合成和分泌TSLP应用不同浓度(lnM、1 OnM、1 OOnM)的 AngⅡ 刺激 BMDMs 72 小时,Western Blot和ELISA法检测发现AngⅡ可促进TSLP的表达和分泌,且呈剂量依赖性。1 OOnM AngⅡ刺激细胞24、48、72小时,检测亦发现AngⅡ可促进TSLP的表达和分泌,且呈时间依赖性。4.4 AngⅡ通过TSLP促进巨噬细胞向M2表型转换应用100nM AngⅡ刺激BMDMs 72小时,Western blot结果示Argl表达明显升高,iNos、MMP9及MMP2表达明显减低。流式细胞术结果显示,AngⅡ刺激显著增加了巨噬细胞M2型表面标志物CD206表达,抑制M1型表面标志物CD86的表达。AngⅡ刺激作用与rTSLP作用一致。用TSLP中和抗体预处理后,可明显抑制AngⅡ诱导的M1、M2型标志物的表达变化。4.5 AngⅡ通过上调TSLP表达,抑制炎症反应应用100nM AngⅡ刺激BMDMs 72小时,ELISA法检测发现细胞上清中抑炎因子(IL-10、TGF-β)含量明显增加,促炎因子(TNF-α、IL-6)含量明显减低。明胶酶谱法检测发现,AngⅡ刺激组MMP2和MMP9的活性较对照组均明显减低(图6B)。AngⅡ刺激作用与rTSLP作用一致,用TSLP中和抗体预处理后可明显抑制AngⅡ诱导的上述指标的变化。5研究结论5.1 TSLP促进巨噬细胞向M2表型转换,抑制炎症反应;5.2 AngⅡ促进巨噬细胞合成和分泌TSLP;5.3 AngⅡ通过上调TSLP促进巨噬细胞向M2表型转换,缓解炎症反应。