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为探索出一套适宜的辽宁绒山羊卵母细胞的体外培养系统,满足科研和生产对早期胚胎的需要,本试验进行了辽宁绒山羊卵泡卵母细胞体外成熟培养和受精的研究。
1.实验比较了切割法和抽吸法从屠宰山羊卵巢表面卵泡采集得到的可用卵母细胞数及成熟率。结果表明切割法采集得到的可用卵母细胞数(2.52枚/卵巢)显著高于抽吸法(1.80枚/卵巢)(P<0.05),但成熟率差异不显著。在辽宁绒山羊卵母细胞收集中,切割法要优于抽吸法。
2.实验检测了收集的卵中成熟卵所占的比率,根据卵丘细胞的完整性将收集到的卵分为三组,COCs、COCs1-3和NOs,成熟卵的比率分别为1.19%、2.56%和4.96%,说明收集的卵中会有少量的成熟卵,而裸卵中成熟卵所占的比率最大。
3.辽宁绒山羊卵母细胞IVM条件为:39℃、5%CO2饱和湿度,基础培养液+10%FCS+10IU/m(l)FSH+20ug/mlLH+25IU/m(l)PMSG;培养22-24h,成熟率可达78.44%,大卵泡卵母细胞成熟率达85.42%的,这与其他山羊相似。
4.实验将卵母细胞体外培养16h、18h、20h、24h、26h,成熟率分别为57.90%、70.02%、73.59%、75.40%、76.66%,随培养时间延长成熟率逐步升高,培养16h的成熟率显著低于18-26h(P<0.05),而培养24h和26h的受精率和卵裂率最高,说明辽宁绒山羊卵母细胞体外培养18h基本达到核成熟,而体外培养24-26h可达胞质成熟,能提高成熟率和受精率。
5.实验用血清培养基和无血清基培养卵母细胞,血清培养基的成熟率(78.44%)略高于无血清培养基(74.10%),但差异不显著(P>0.05)。说明在辽宁绒山羊可用无血清培养基进行卵母细胞的体外成熟培养。
6.辽宁绒山羊卵母细胞IVF时,悬浮法适合于细管冻精中高活力精子的获取;IVF条件为:38.5℃、5%CO2饱和湿度,精子洗涤液和受精液采用mTyrode液,获能液采用mTyrode液+20μg/ml肝素钠,受精卵培养液为基础培养液+20%FCS;受精率和卵裂率可达60.63%和41.75%,这比绵羊的报道要低。
7.实验比较了卵泡直径对卵母细胞回收率和体外培养效果的影响,直径≤2mm、2.1-5mm和5mm以上三类卵泡的回收率分别为56.01%、51.91%和50.57%,可用卵的比率分别为85.42%、72.75%和58.39%,成熟率分别为96.00%、73.42%和54.91%。结果表明:卵母细胞的回收率和可用卵的比率及成熟率均与卵泡直径呈正相关;直径2.1-5mm卵泡的卵母细胞受精率和卵裂率分别为59.15%和42.50%,显著高于直径>5mm卵泡和≤2mm卵泡(P<0.05),适合体外胚胎的生产;直径≤2mm卵泡的卵母细胞因未发育充分体外发育潜能最差;直径>5mm卵泡的卵母细胞可能因体外培养成熟过度而老化导致受精率和卵裂率降低。
8.实验测定了卵丘细胞对卵母细胞体外成熟和受精的影响,第一步,将一部分COCs经机械吹打脱除卵丘细胞成为DOs,然后以DOs、DOs(COCs)、DOs(CCs)、COCs四种方式培养,第二步将所获COCs、COCs1-3、NOs各自单独培养。结果表明,COCs组的成熟率、受精率和卵裂率分别为82.85%、60.63%和41.75%,极显著高于其它三组(P<0.01),卵丘细胞的存在有利于卵母细胞体外成熟和随后的发育,COCs组成熟率、受精率和卵裂率分别为83.25%、59.43%和42.50%,显著高于COCs1-3组(P<0.05)且极显著高于NOs组(P<0.01),卵丘细胞的完整性也影响着卵母细胞的体外发育。