目的：　　本研究通过脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导建立小鼠急性肺损伤（Acute Lung Injury,ALI）模型，探索受体相互作用蛋白（Receptor-interact protein，RIP）家族成员在ALI模型中的作用，并对急性肺损伤小鼠给予RIP-1抑制剂Necrostatin-1干预治疗。通过检测小鼠肺组织组病理学改变、肺灌洗液中相关炎症因子的表达、髓过氧化物酶(MPO)活性，以及肺组织RIP激酶家族的表达、体内生存期的变化、necrostatin-1在组织及体外细胞水平的信号通路、炎症反应的作用，探讨急性肺损伤的发病机制，以及RIP-1抑制剂Necrostatin-1作为潜在急性肺损伤治疗策略的可行性。　　材料和方法：　　1. ALI模型的建立选取12只8周龄BALB/c雄性小鼠为研究对象，随机分为对照组和ALI（脂多糖诱导ALI）组，每组各6只。ALI组通过尾静脉注射脂多糖（LPS，10 mg/kg）诱导ALI，对照组通过尾静脉注射相同体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。两组小鼠均在造模后24h，断颈处死小鼠，剥离小鼠肺组织，组织病理学染色（H&E）检测小鼠肺组织病理；利用酶联免疫吸附实验（ELISA）评估肺灌洗液和血液中炎症相关因子白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-8、IL-1β、环氧合酶-2（COX-2）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的表达情况，以此来评价ALI模型的建立效果。　　2.利用蛋白质印迹（Western blot）和免疫组织化学（IHC）染色测定对照组和ALI组的小鼠肺组织中RIP激酶家族（RIP-1，RIP-2和RIP-3）的表达水平。　　3．necrostatin-1体内实验将18只8周龄的BALB/c雄性小鼠随机分为对照组、ALI（LPS+DMSO）组、necrostatin-1组，每组6只。ALI组和necrostatin-1组小鼠行LPS诱导ALI（方法同1 ALI组），对照组为正常对照组（方法同1对照组）。necrostatin-1组在 LPS经尾静脉注射建模的同时，腹腔注射特异性 RIP-1抑制剂 necrostatin-1（10mg/kg）;ALI组在LPS经尾静脉注射建模的同时，腹腔注射二甲基亚砜（DMSO），作为necrostatin-1治疗组对照。观察各组小鼠生存时间，以及肺组织的组织病理学变化。在necrostatin-1和二甲基亚砜腹腔注射24小时后，断颈处死小鼠，剥离小鼠肺组织、收集肺灌洗液，然后分别利用组织病理学技术和免疫组织化学染色技术检测小鼠肺组织形态和RIP-1表达情况；利用Western blot检测小鼠肺组织中RIP-1的表达情况和下游靶标NF-κB信号通路蛋白的表达情况；利用ELISA检测肺灌洗液和血液中炎症相关因子IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β、COX-2、MCP-1的表达情况；测定小鼠肺组织中髓过氧化物酶（MPO）活性。　　4.细胞水平的研究将小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分为对照组、DMSO+LPS组、necrostatin-1+LPS三组。其中，DMSO+LPS组和necrostatin-1+LPS组中，经LPS处理后，分别利用溶剂对照DMSO和necrostatin-1进行处理。然后收集小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞总蛋白和细胞培养上清，利用western blot检测细胞中RIP-1和IKKα（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase-α），NF-κB p50和NF-κB p65蛋白的表达；利用ELISA检测细胞培养上清中炎症相关因子IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β、COX-2、MCP-1的表达情况。　　结果：　　1.LPS诱导的肺损伤模型的建立和鉴定病理学H&E染色镜检发现，ALI组与对照组相比，注射LPS的ALI组小鼠中出现典型的肺损伤现象，肺泡结构大面积破坏，广泛的肺水肿，肺泡间隔增厚，肺泡严重出血，肺泡塌陷，以及明显的炎症细胞浸润，肺损伤评分升高（p<0.05）。ELISA检测炎症因子发现，ALI组与对照组相比，ALI组的肺灌洗液（BALF）和肺组织中IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β、COX-2、MCP-1表达水平显著高于对照组（p<0.05）。　　2.LPS诱导的肺损伤对RIP家族蛋白的影响 Western blot检测RIP家族蛋白发现，ALI组与对照组相比，ALI组中RIP-1蛋白的表达水平显著增加（p<0.05），而RIP-2和RIP-3的表达水平无明显差异（p>0.05）。免疫组化(IHC)检测肺组织发现ALI组与对照组相比，ALI组中RIP-1阳性的细胞数比例显著高于对照组（p<0.05）。　　3.RIP-1抑制剂Necrostatin-1减轻LPS诱导的肺损伤的作用研究组织病理学染色发现，necrostatin-1组与DMSO处理ALI组相比，necrostatin-1组中的炎性细胞浸润到肺泡和肺实质的数量减少，在肺泡和肺泡塌陷中出血量降低，同时，肺损伤评分也显著降低（p<0.05）。Western Blot检测necrostatin-1治疗后的肺组织总蛋白中RIP-1的表达量，necrostatin-1组与DMSO处理ALI组相比，necrostatin-1组RIP-1蛋白水平下调，经过necrostatin-1的处理，RIP-1的蛋白水平比ALI组的减少了75.1%。免疫组织化学检测染色发现，necrostatin-1组与ALI组相比，经过necrostatin-1治疗的ALI小鼠肺组织中RIP-1阳性细胞数比ALI组的小鼠明显减少，由ALI组的62.5%降低到necrostatin-1组的18.3%。生存期实验，necrostatin-1组与ALI组相比，LPS建模并经necrostatin-1治疗后小鼠死亡数量比ALI组明显减少，72小时后仅两只小鼠死亡（2/10），ALI组中，42小时后已死亡8只（8/10），说明Necrostatin-1治疗能显著延长LPS诱导的急性肺损伤的小鼠的存活时间（p<0.05）。ELISA检测发现Necrostatin-1治疗后肺灌洗液和肺组织中相关炎症因子TNF-a、IL-6、IL-1、IL-8、COX-2、MCP-1的表达显著低于ALI组（p<0.05）。　　4.Necrostatin-1减轻肺损伤结果　　（1）MPO活性检测，necrostatin-1组与ALI组相比，necrostatin-1组肺部炎症水平显著降低。　　（2）Western blot检测RIP-1的潜在下游靶标NF-κB信号通路，ALI组与对照组相比，ALI组NF-κB异常活化，并介导LPS诱导的炎性细胞因子表达上调（p<0.05）。而necrostatin-1组与ALI组相比，necrostatin-1组中NF-κB的活化受到抑制，并伴随着IKKα和NF-κB p50的下调，以及炎性细胞因子IL-6，TNF-α，IL-8，COX-2，MCP-1和IL-1β的下调（p<0.05）。　　（3）细胞水平上，用CCK8试剂检测细胞活力，necrostatin-1处理组与对照组相比，经过不同浓度的Necrostatin-1处理48小时后，细胞的活力无显著变化（p>0.05）。　　（4）Western blot检测处理后小鼠巨噬细胞 RAW264.7细胞总蛋白，Necrostatin-1+LPS组与DMSO+LPS组相比，Necrostatin-1+LPS组RIP-1的表达下调，NF-κB信号通路中的重要因子IKKα，NF-κB p50和NF-κB p65的表达下调。　　（5）ELISA检测RAW264.7细胞培养上清中相关炎症因子，DMSO+LPS组与对照组相比，DMSO+LPS组中IL-6，TNF-α，IL-8，COX-2，MCP-1和IL-1β表达的上调（p<0.05）。Necrostatin-1+LPS组与DMSO+LPS组相比，Necrostatin-1+LPS组中IL-6，TNF-α，IL-8，COX-2，MCP-1和IL-1β表达的下调（p<0.05）。　　结论：　　1、静脉注射LPS能成功诱发小鼠的急性肺损伤模型，可导致肺部水肿，广泛的肺泡壁增厚，肺泡严重出血，肺泡塌陷，明显的炎症细胞浸润和较高的肺损伤评分。　　2、在ALI小鼠模型中，LPS诱导后，RIP激酶家族蛋白中，RIP-1蛋白异常高表达，而RIP-2和RIP-3的表达量无明显差异。　　3、RIP-1的特异性小分子抑制剂necrostatin-1能有效的抑制RIP-1蛋白水平并缓解急性肺损伤症状，延长急性肺损伤小鼠的生存时间，降低促炎症细胞因子和趋化因子的表达。　　4、Necrostatin-1能有效抑制小鼠肺组织中RIP-1及NF-κB信号通路的活化，从而抑制ALI模型的炎症反应和降低肺损伤程度。在小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中，Necrostatin-1通过有效的逆转RAW264.7细胞中LPS对NF-κB信号通路中的重要因子IKKα，NF-κB p50和NF-κB p65的表达调控作用减轻了LPS诱导的炎症反应。　　总而言之，通过抑制炎症和NF-κB活化，necrostatin-1可有效缓解LPS诱导的小鼠急性肺损伤症状。因此，necrostatin-1可能是急性肺损伤治疗的新型候选药物。