前言阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是发生在老年人群的一种以进行性痴呆和情感障碍为临床特征的神经退行性疾病。AD最主要的病理学特征是细胞外出现大量的以β-淀粉样蛋白(amyloid-βprotein, Aβ)为主要组成成分的老年斑。Ap是由淀粉样肽前体蛋白(amyloid-βprecursor protein, APP)经分泌酶剪切产生。APP的外功能区首先由β-分泌酶剪切并产生一个APP C-端片段,此片段进一步由γ-分泌酶复合体在其跨膜区域进行剪切,进而形成Aβ多肽。APP以及它的蛋白水解产物Aβ都是金属蛋白,分子上有锌结合位点,锌离子与这些蛋白结构的稳定性密切相关。近年来研究发现在AD患者的大脑以及转基因小鼠大脑Aβ老年斑内有大量锌离子沉积,锌离子通过调节mRNA的5’-UTR来促进APP的表达,更重要的是体外实验证明锌离子通过共价键与相邻两条Aβ分子第13位上的组氨酸结合,从而使Aβ聚合并形成纤维状沉积。此外,锌螯合剂CQ、DP-109等都可以降低脑内锌含量,改善AD病人的认知功能状态,抑制AD转基因小鼠大脑内老年斑的形成。综上可见,AD脑中锌含量的异常可能是导致Aβ积聚的一个重要因素,改善锌代谢紊乱可能是治疗AD的一个潜在策略。在动物在体水平,锌离子对AD发病的病理过程及老年斑形成的影响机制目前尚无详细报道。因此,本研究以AD模型小鼠-APP/PS1转基因小鼠做为实验对象,分别用锌离子和锌螯合剂氯碘羟喹(clioquinol, CQ)处理动物,结合行为学、形态学和分子生物学等手段,检测锌离子对APP/PS1小鼠的学习记忆能力、脑内老年斑形成、APP蛋白及其酶切产物以及Aβ分泌的影响,揭示锌离子参与AD病理生理过程的分子机制。材料与方法42只3月龄健康雄性C57BL／6小鼠,随机均分为3组：(1)正常对照组；(2)溶剂对照组：腹腔注射等量二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO); (3) CQ组：腹腔注射CQ (Sigma, 100mg/kg,用DMSO溶解为1％的储存液)。断头取脑,做TSQ荧光探针染色和金属自显影技术(AMG)组织化学染色。48只3月龄雄性APP／PS1转基因鼠随机均分为4组：(1)正常对照组；(2)高锌组(喂饲含ZnSO4的水,浓度20mg/ml); (3)锌+CQ组(喂饲含ZnSO4的水,浓度20mg/ml,至7月龄时管饲法给予20mg／kg的CQ)；(4)CQ组(7月龄时管饲法给予20mg／kg的CQ)。每天记录一次体重变化。当小鼠到9月龄时,做Morris水迷宫实验,检测各组小鼠的学习记忆能力。随后心脏取血并分离血清,进行原子吸收光谱检测,分析各组小鼠血清锌的变化。断头取脑,大脑左半球固定做冰冻切片,右半球分离皮层和海马,做分子生物学检测。应用AMG和免疫组织化学技术检测各组小鼠脑内Aβ老年斑的变化；应用Western Blot技术检测各组小鼠大脑皮层APP、ADAM10、BACE1、PS1、sAPPα、sAPPβ蛋白表达的变化；应用ELISA技术检测Aβ在各组小鼠大脑皮层的含量。实验结果1.CQ对锌离子螯合作用的检测腹腔注射CQ组小鼠大脑锌离子的TSQ荧光探针染色和AMG组织化学染色均明显低于正常对照组和溶剂对照组,而溶剂对照组和正常对照组之间没有明显差异。2.锌离子致转基因鼠体重及血清锌、脑锌含量的变化与对照组相比,给锌组转基因鼠的体重显著下降,毛色变棕黄,血清锌、脑锌含量显著增高。锌螯合剂CQ能逆转锌对APP/PS1转基因鼠的毒性作用,但是其自身对转基因鼠的肤色和体重没有影响。3.锌离子对转基因鼠学习记忆能力的影响与对照组相比,给锌组转基因鼠的学习记忆能力和空间探索能力均显著降低,而锌螯合剂CQ能一定程度改善高锌喂养对APP/PS1转基因鼠学习记忆能力的影响,并且其本身也能显著改善APP/PS1转基因鼠的认知能力。4.锌离子对转基因鼠脑内老年斑形成的影响与对照组相比,给锌组转基因鼠的大脑皮层、海马的老年斑块明显增多。锌螯合剂CQ能减缓锌对老年斑形成的促进作用,CQ本身亦能显著降低转基因鼠脑内老年斑的数量。5.锌离子对转基因鼠脑内APP蛋白及其分解酶、分解产物表达的影响与对照组相比,给锌组转基因鼠脑内APP、BACE1、PS1、sAPPβ蛋白表达明显增多,Aβ含量明显增加,ADAM10和sAPPa表达下降；CQ组转基因鼠脑内APP、BACE1、PS1、sAPPβ蛋白表达和可溶性Aβ含量减少,ADAM10和sAPPa蛋白表达明显增强。结论1.CQ对游离锌离子有明显的螯合作用。2.高锌使APP/PS1转基因鼠的体重下降,血清锌、脑锌含量升高。3.高锌使APP/PS1转基因鼠的认知能力显著下降。4.高锌能促进APP/PS1转基因鼠脑内老年斑的生成。5.高锌能影响APP/PS1转基因鼠脑内APP、APP代谢酶及其产物表达。