目的:骨骼肌是人体最大的器官之一,占人体质量的40%以上,除了维持人体正常运动、呼吸功能外,在调节人体代谢和内分泌系统等生理活动中也起着重要作用。因此,骨骼肌质量的减少或者功能的异常势必会导致人体功能性的活动能力减弱、从而导致生活质量的下降以及患重症疾病后生存率的减低,尤其在老年人中更为明显。所以,深入探讨骨骼肌生成的机制研究越来越受到大家的关注。骨骼肌是一个高度分化的组织,由肌纤维束组成,肌肉收缩后能够产生力量、维持运动。骨骼肌生成发生在生命进程的多个阶段,包括胚胎发育、成年骨骼肌的生长以及损伤后的再生和修复。肌纤维由参与发育过程中被称为成肌细胞和卫星细胞的单核前体细胞融合而成,在肌肉损伤和再生期间卫星细胞可以被激活并分化为能够形成肌纤维的干细胞。此外,成肌细胞向肌纤维分化是一个多步骤的过程,包括退出细胞周期、启动肌肉特异性转录程序、细胞伸展和细胞融合。成肌细胞融合是骨骼肌发育的关键步骤之一。在成肌细胞融合过程中可以发生多种细胞事件,包括细胞迁移、细胞粘附、细胞延长、细胞识别和排列。为了使成肌细胞相互融合,伸展的成肌细胞必须粘附于其他成肌细胞的表面,并且正确识别细胞膜上的跨膜蛋白。此外,多种调节细胞-细胞接触形成和识别的调节因子也参与了成肌细胞融合的过程,其中包括N-和M-钙粘着蛋白,caleolin-3,N-和V-血管细胞粘附因子和经典的整联蛋白,这些蛋白质在成肌细胞分化中的作用均在体内和原代细胞体外研究中得到了证实。例如,N-钙黏着蛋白的表达贯穿在小鼠骨骼肌成肌的整个过程;而在成肌细胞中N-钙黏蛋白能够促进成肌细胞的分化,启动肌肉特异性蛋白的表达。在胚胎前体细胞和发育的成肌细胞中,均可以检测到M-钙黏着蛋白;在成年骨骼肌中,M-钙黏着蛋白表达于静置的卫星细胞以及再生骨骼肌中。整联蛋白β1被证明参与成肌细胞融合和肌纤维细胞骨架的组装。整联蛋白α3也被证明在体外促进成肌细胞的分化。因此,成肌细胞粘附对于成肌细胞融合至关重要。核孤儿受体4A1（Nuclear receptor 4A1,Nur77,Nr4a1）是核孤儿受体4A亚家族中最重要的成员,同时也是研究最深入的成员,已经被证实在多种组织中参与调节不同的生物学及生理学进程,例如组织发育、细胞增殖、细胞凋亡和能量代谢。在骨骼肌中,Nur77的功能大部分与β-肾上腺素受体信号通路有关。在骨骼肌中,Nur77参与骨骼肌发育、骨骼肌生成和葡萄糖转运蛋白4（Glut4）介导的葡萄糖代谢。研究表明,敲除小鼠胚胎中的Nur77可以抑制骨骼肌的发育;骨骼肌特异性敲除Nur77会导致骨骼肌葡萄糖代谢的紊乱。相反,Nur77过表达显著增加骨骼肌的氧化能量代谢、线粒体的生物合成。亦有报道指出Nur77在成肌细胞中可以促进肌生成特异性因子（Myo D和Myo G）的表达增加,进而促进成肌细胞的融合。上述的结果均提示,Nur77是维持骨骼肌正常生理功能的重要调节因子。但是,关于Nur77在成肌细胞中的研究尚不深入,以及Nur77在正常条件下对成肌细胞粘附的研究尚无报道。本研究旨在通过建立Nur77过表达的动物模型和Nur77过表达以及低表达的成肌细胞模型,在体内观察Nur77对骨骼肌质量、骨骼肌功能的影响以及在体外观察Nur77对成肌细胞粘附的影响,试图从成肌细胞粘附的角度阐明Nur77促进肌生成的机制。方法:第一部分:Nur77对小鼠骨骼肌生成的影响1.从NCBI GEO数据库中下载骨骼肌萎缩和骨骼肌生成的RNA-seq和微阵列数据库,从Uniprot KB数据库中下载骨骼肌相关转录因子数据库,通过生物信息学方法筛选出重要的成肌调节因子。2.选取2月龄雄性C57BL/6小鼠共10只,随机分为对照组（Con-AAV）和Nur77过表达组（Nur77-AAV）,每组各5只,腓肠肌局部注射对照病毒和Nur77过表达AAV构建Nur77过表达小鼠模型。3.病毒注射4周后应用小鼠抓力测定仪检测小鼠的抓力,麻醉处死后检测腓肠肌的质量;H&E染色观察腓肠肌组织的形态结构。第二部分:Nur77对骨骼肌细胞粘附的影响1.体外培养小鼠成肌细胞系（C2C12）,转染对照慢病毒和Nur77过表达慢病毒,转染后进行嘌呤霉素筛选构建过表达对照（Control）和Nur77过表达（Nur77）的稳转细胞系并应用Western blot和qRT-PCR验证细胞模型。2.体外培养小鼠成肌细胞系（C2C12）,转染shRNA对照慢病毒和Nur77shRNA慢病毒,转染完成后进行嘌呤霉素筛选构建低表达对照（Control）和Nur77低表达（sh-Nur77）稳转细胞系并应用Western blot和qRT-PCR验证细胞模型。3.对Nur77过表达以及Nur77低表达的成肌细胞进行鬼笔环肽细胞骨架染色观察其形态变化。4.应用qRT-PCR和Western Blot检测Nur77过表达成肌细胞,Nur77低表达成肌细胞以及Nur77-AAV小鼠腓肠肌中粘附因子的mRNA表达和蛋白表达。5.应用免疫荧光技术检测Nur77过表达成肌细胞,Nur77低表达成肌细胞以及Nur77-AAV小鼠腓肠肌粘附因子的表达量和细胞定位（N-cadherin）。第三部分:Nur77影响成肌细胞粘附和骨骼肌生成的机制研究1.从Ch EA3转录因子预测网站预测调节细胞粘附因子的上游基因。2.从NCBI GEO数据库中下载数据库,分析Nur77和Zeb1之间的相关性。3.应用qRT-PCR和Western Bolt检测Nur77过表达细胞和Nur77低表达细胞中Zeb1 mRNA水平和蛋白水平的变化。4.在成肌细胞中,通过转染对照（Control）和Zeb1小干扰RNA（si Zeb1）构建Zeb1低表达细胞模型,应用Western blot和qRT-PCR验证细胞模型。5.应用qRT-PCR检测si Zeb1及其对照细胞的细胞粘附因子的转录水平表达;应用Western Blot检测细胞粘附因子的表达（N-cadherin）。6.在Nur77低表达成肌细胞（sh-Nur77）和对照成肌细胞中转染Zeb1过表达质粒和对照质粒,应用Western blot检测细胞粘附因子（N-cadherin）蛋白表达;应用鬼笔环肽细胞骨架染色观察其形态变化。7.应用JASPAR网站预测Nur77结合序列元件在Zeb1启动子区域的结合位点。8.应用Ch IP和荧光素酶报告实验检测Nur77对Zeb1转录活性的调控作用。9.在Nur77低表达及其对照的成肌细胞中转染Zeb1过表达质粒和对照质粒,在成肌诱导条件下培养5天,通过显微镜明场观察肌管生成情况。结果:第一部分:Nur77对小鼠骨骼肌生成的影响1.从骨骼肌萎缩和骨骼肌生成的RNA-seq和微阵列数据库中筛选出205个差异基因,这些差异基因再与骨骼肌生成的转录因子基因集相交,筛选出Nur77作为重要的骨骼肌调控因子。2.与Control组小鼠（Con-AAV）相比,Nur77过表达小鼠（Nur77-AAV）的抓力增大;腓肠肌质量高于对照组;骨骼肌纤维横截面积比对照组明显增大。第二部分:Nur77对骨骼肌细胞粘附的影响1.鬼笔环肽结果显示,与对照组成肌细胞相比,Nur77过表达组成肌细胞面积增大,细胞形态更加伸展,细胞间连接明显增多。2.鬼笔环肽结果显示,与对照组成肌细胞相比,Nur77低表达组成肌细胞面积减小,细胞的突触更聚集,细胞间连接明显减少。3.与对照成肌细胞相比,Nur77过表达组成肌细胞的细胞粘附因子的mRNA水平升高,N-cadherin的蛋白水平表达升高,免疫荧光结果显示更多的N-cadherin聚集在成肌细胞连接处。4.与对照成肌细胞相比,Nur77低表达组成肌细胞的细胞粘附因子的mRNA水平减低,N-cadherin的蛋白水平表达减低,免疫荧光结果显示更少的N-cadherin聚集在成肌细胞连接处。5.与对照组小鼠相比,在Nur77过表达的小鼠腓肠肌组织中,细胞粘附因子的mRNA水平升高,Ncadherin的蛋白表达升高,免疫荧光显示更多的N-cadherin聚集在肌纤维周围。第三部分:Nur77影响成肌细胞粘附和骨骼肌生成的机制研究1.通过对Nur77和差异性基因进行相关性分析,Nur77和Zeb1之间的相关性最高。2.与对照成肌细胞相比,Nur77过表达组成肌细胞的Zeb1的mRNA水平和蛋白水平升高;与对照成肌细胞相比,Nur77低表达组成肌细胞的Zeb1的mRNA水平和蛋白水平减低。3.在成肌细胞中转染Zeb1 siRNA后,会减少细胞粘附因子mRNA水平的表达以及N-cadherin蛋白水平的表达。4.与对照成肌细胞相比,在Nur77低表达成肌细胞中转染外源性Zeb1过表达质粒后N-cadherin的表达增加,成肌细胞间接触增加。5.JASPAR网站预测结果提示,在Zeb1的转录起始位点前有3个能与Nur77结合的作用位点（P1,P2,P3）。6.Ch IP和荧光素酶报告实验结果提示Nur77能够和Zeb1转录起始位点前的P1 DNA序列结合。7.在Nur77低表达成肌细胞中转染外源性Zeb1过表达质粒后诱导形成的肌管数量明显多于Nur77低表达成肌细胞转染对照质粒组。结论:第一部分:Nur77对小鼠骨骼肌生成的影响1.Nur77在骨骼肌中作为重要的转录因子调节骨骼肌生成。2.Nur77可以增加小鼠的抓力、增加肌肉质量和扩大肌纤维横截面积。第二部分:Nur77对骨骼肌细胞粘附的影响1.Nur77在成肌细胞和小鼠骨骼肌中可以促进成肌细胞间的连接,增加细胞粘附因子的表达。第三部分:Nur77影响成肌细胞粘附和骨骼肌生成的机制研究1.在成肌细胞中Zeb1调节细胞粘附因子的表达。2.Zeb1作为重要的中间环节参与Nur77介导的成肌细胞粘附和骨骼肌融合。