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海藻酸裂解酶在海藻酸生物能源的开发、生理活性寡糖的制备、海藻原生质体制备和治疗囊肿性纤维等方面具有巨大的应用前景。因此研究不同海藻酸裂解酶的酶学特性、阐明微生物对海藻酸的降解和代谢机理,具有重要的理论意义和应用价值。本文研究了来自厌氧菌SH-52菌株的海藻酸裂解酶及海藻酸代谢关键酶的特性,并分析了其海藻酸的降解机理。结果如下:1.Sunxiuqinia sp.SH-52海藻酸裂解酶的原核表达及酶学特性分析从本实验室分离筛选的Sunxiuqiniasp.SH-52中成功克隆出4种海藻酸裂解酶基因SHA-2,SHA-3,SH4-4和SHA-5,并在大肠杆菌中成功表达。经纯化后4种海藻酸裂解酶的活性分别达到5.2U/mg,12U/mg,21U/mg,20U/mg。酶学分析结果显示SHA-2,SHA-3,SHA-4和SHA-5的最适温度分别为65℃、55℃、37℃和55℃;最适pH均为7.5;4种酶均具有双底物特异性,其中SHA-2和SHA-5对PolyG具有更强的底物特异性,SHA-3和SHA-4对PolyM具有更强的底物特异性;其催化海藻酸的Km值分别为4.3 mg/mL、0.55mg/mL、2.5 mg/mL 和 3.6 mg/mL,Vmax 分别为 13.46 U/mL、3.1 U/mL、8.7 U/mL 和 7.8 U/mL;薄层层析(TLC)结果表明SHA-1和SHA-5为内切型海藻酸裂解酶,SHA-2、SHA-3和SHA-4为外切型海藻酸裂解酶。2.海藻酸降解机理的研究分别对来源于好氧海藻酸分解菌Sphingomonas sp.ZH0的4种海藻酸裂解酶和来源于厌氧海藻酸分解菌Sunxiuqiniasp.SH-52中的5种海藻酸裂解酶进行了海藻酸降解的研究。结果表明,来源于Sphingomonas sp.ZH0的4种海藻酸裂解酶,无论其底物是海藻酸钠、PolyM还是PolyG,ZHO-I、ZHO-Ⅱ、ZH0-Ⅲ三种内切酶之间均具有协同作用,其中ZH0-Ⅰ与ZH0-Ⅲ之间的协同作用最大;当单一内切酶与外切酶ZH0-Ⅳ进行酶促反应时,以PolyG为底物的外切酶ZH0-Ⅳ与内切酶ZH0-Ⅱ和ZH0-Ⅲ之间均无协同作用,除此之外其余的单一内切酶与外切酶组合均具有协同作用,以PolyM为底物时ZH0-Ⅲ和ZH0-Ⅳ的协同度在所有组合中最高,为4.2。对于来源于Sunxiuqinia sp.SH-52的5种海藻酸裂解酶:以海藻酸为底物时,SHA-4和SHA-5之间的协同度最高为1.9。以PolyM为底物时,内切型酶SHA-1和SHA-5之间无协同作用;外切型酶之间均有协同作用;内外切型组合中SHA-1和SHA-3以及SHA-3和SHA-5之间无协同作用。以PolyG为底物时,两种内切型酶SHA-1和SHA-5之间的协同度为1.6;外切型之间也有协同作用,其中SHA-3和SHA-4混合时协同度最高,为2.1;内外切型酶组合均有协同作用,以SHA-1和SHA-2之间的协同度最高,为2.2。总体来看,以PolyG和PolyM为底物时协同度相对较高,因此在制备单体时可以考虑通过先将海藻酸处理为PolyG和PolyM,然后进行酶解来提高效率。3.海藻酸代谢关键酶的重组表达及特性研究选择最优组合对制备获得的PolyG和PolyM进行酶解后,获得的海藻酸单体高达30%(m/m)。从菌株Sunxiuqinia sp.SH-52中克隆获得海藻酸代谢关键酶DEH还原酶和KDG激酶的基因,并分别进行原核表达。SDS-PAGE结果表明DEH还原酶和KDG激酶的分子量分别为53 kDa和64 kDa左右(GST融合标签),且分别仅需6h和8h的诱导便达到最大的蛋白量,分别为1623 mg/L和873.5 mg/L;纯化后酶活分别为10.3 U/mg和11 U/mg。通过分子手段成功构建重组质粒pGEX-4T-1-dehR-KdgK,表达结果表明两个酶的基因同时进行了表达且均具有活性。