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β干扰素(IFNβ)是干扰素家族中的一员,具有广谱抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节作用。为了改善IFNβ的体内稳定性,雷楗勇等构建了β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HSA)融合基因,将其在毕赤酵母系统中进行表达,得到了长效融合蛋白IFNβ-HSA。这种融合蛋白具有广阔的生产及临床应用前景。但是该菌株表达量较低,为进一步提高IFNβ-HSA的表达量,本文构建双重重组酵母,使其共表达具有分子伴侣活性的蛋白质二硫键异构酶(PDI),并分析产量差异。为进一步提高IFNβ-HSA定量分析方法的灵敏度,本文对实验条件进行优化,并对新方法进行考核。参照GenBank数据库登记号为EU805807的PDI基因序列设计引物,以毕赤酵母基因组为模板,采用PCR方法,扩增PDI基因。将其插入到克隆载体pMD19-T中,构建重组质粒pMD19T- PDI,进行测序。测序结果显示克隆得到的PDI基因与GenBank公布的PDI基因序列完全一致。将该基因插入毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组表达载体pPICZαA-PDI,经SacⅠ线性化后电击转化毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA,得到双重表达PDI和IFNβ-HSA的双重重组子。摇瓶发酵结果表明,共表达PDI的菌株较原始菌株目的蛋白IFNβ-HSA产量提高60%。IFNβ-HSA双抗体夹心ELISA检测方法的优化。将纯化后的IFNβ-HSA融合蛋白作为抗原标准品,优化缓冲体系、抗体工作浓度及实验条件,建立了新的检测方法。该方法的灵敏度达到13.88 ng/mL,线性检测范围21.01 ng/mL~672.50 ng/mL,相关系数R2>0.99。经方法学考核,批内、批间变异系数分别为2.46~8.89%和2.79~9.74%,发酵液上清回收率为91.30~108.44%,与IFNβ、HSA基本无交叉反应,健全性分析表明发酵液及小鼠血清稀释倍数对该方法无影响,稳定性试验显示预包被酶标板可在4℃下稳定保存3个月以上。本文研究结果表明共表达PDI能够提高IFNβ-HSA的产量,高产菌株的获得,为后续发酵及纯化工艺研究提供方便。IFNβ-HSA双抗体夹心ELISA检测方法可用于发酵过程中融合蛋白的检测,可以有效检测目的蛋白的含量,为发酵工艺的优化提供了必要的数据支持,并为后期药代动力学以及临床研究提供了备选分析方法。