【摘 要】
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植物抗寒分子机理的研究对提高植物的抗寒性,解决农作物的抗寒问题具有重大的意义.该论文在查阅了大量中外文献的基础上,利用生物技术克隆了与抗寒有关的基因COR15a和CBF1,并
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植物抗寒分子机理的研究对提高植物的抗寒性,解决农作物的抗寒问题具有重大的意义.该论文在查阅了大量中外文献的基础上,利用生物技术克隆了与抗寒有关的基因COR15a和CBF1,并将CBF1构建了受水杨酸诱导的植物表达载体.尽管前人在植物抗寒基因工程方面做了很多工作,但是转入单个基因和组成型表达的瓶颈始终没有解决.为此该研究完全采用拟南芥的相关序列,充分利用其本身的调控机制,达到对目标基因的诱导和高效表达.并且我们将两个基因构建到一起以及诱导型启动子的使用可以避免单个基因和组成性表达造成的缺陷.我们从Genebank获得拟南芥COR15a和CBF1基因的序列,根据此序列设计引物.我们在COR15a的上游引物设计了SacⅠ酶切位点,在CBF1的上游引物设计了BamHI酶切位点,在下游引物设计了SacⅠ的酶切位点.在实验过程中我们用SDS法提取材料的基因组作为模板,用降落PCR获得了特异的扩增片断COR15a(1160bp左右),CBF1(750bp左右),并用琼脂糖凝胶电泳对目的片断进行回收,利用试剂盒对回收片断进行纯化.将纯化的PCR产物连接到pGEM-T Easy Vector上,并转化DH5a进行克隆.对COR15a我们采用PCR鉴定,对CBF1我们采用酶切鉴定,通过PCR鉴定和酶切鉴定筛选到COR15a和CBF1的阳性克隆.对CBF1我们又做了进一步的工作,构建了含有诱导型启动子的植物表达载体.将CBF1基因用SacⅠ和BamHI从T-载体切下,同时用这两个酶去切pUSI21(其上带有受水杨酸诱导的启动子)使其线性化,然后将二者连接,进行转化,鉴定.用HindⅢ和SacⅠ双酶切pUSI-SA-CBF1,同时用这两个酶去切pBI121,将二者连接转化EHA105,进行PCR鉴定.
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