恶性胶质瘤是常见的颅脑肿瘤,也是血管最丰富的人类实体肿瘤之一。由于具有较强的侵袭性和易复发,恶性胶质瘤的治疗至今仍难以攻克。在许多针对恶性胶质瘤的实验治疗方法中,有些方法已通过体外和动物体内实验的验证,并进入临床试验。但迄今的结果证明,这些方法仍不能根本改变这一恶性肿瘤的致命转归。近十余年来,有关肿瘤分子生物学与分子遗传学研究进一步深化,阐明了肿瘤的发生与发展是一个多因素、多基因、多阶段的复杂过程,也提示对肿瘤综合治疗的理念和方法也应多渠道,多靶点,多时相。我们实验设想是,通过对经外周血诱导培养得到的EPCs进行基因修饰,使其携带联合自杀基因CD-UPRT(cytosine deaminase-uracil phosphoribosyltransferase);EPCs对肿瘤血管具有趋向性,可以到达肿瘤部位并原位整合入肿瘤血管内皮,弥散入肿瘤实质;给予前体药物后,EPCs发生凋亡,破坏肿瘤血管生成;同时EPCs凋亡而产生的旁观者效应进一步杀伤肿瘤细胞。实验将探讨以肿瘤血管和肿瘤细胞为双重靶点联合应用抗血管生成疗法和自杀基因疗法的可行性。本研究将重点完成外周血分离诱导培养EPCs并对其进行基因修饰;观察经CD-UPRT基因修饰的EPCs对前体药物5-FC的反应性及旁效应对恶性胶质瘤细胞的体外杀伤作用。研究结果将为进一步的实验研究提供了理论和实验依据。将外周血经密度梯度离心得到的单个核细胞,用含有诱导因子的内皮细胞培养基EGM-2体外诱导培养。在培养第7天时大部分细胞拉长呈梭形,部分细胞呈极性排列,并有克隆集落形成,说明所得细胞已开始向内皮细胞分化;吞噬ac-LDL(acetylated-low-density lipoprotein)并与UEA-1(ulex europaeus agglutinin)结合证实了其具有内皮细胞表型;免疫荧光检测到CD34、CD133、VEGFR-2的表达,流式细胞仪检测各种指标阳性细胞比例为:CD34~+占37.645%,CD133~+占45.655%,VEGFR-2~+占57.3%,其中CD34~+与CD133~+双阳性细胞占29.44%,CD34~+与VEGFR-2~+双阳性细胞占28.38%。体外诱导培养可使EPCs较培养初期扩增近100倍。通过粘附和Transwell实验证明了所得细胞有良好的粘附能力和向VEGF等趋化因子的迁移能力。接着我们用脂质体转染法将携带联合自杀基因CD-UPRT真核表达载体pCEA CD CAUP转入EPCs内,并通过RT-PCR法检测到经转染的细胞群有自杀基因CD及UPRT的mRNA表达。为了进一步证明经转染的EPCs表达CD-UPRT基因,我们观察了不同浓度5-FC对经基因修饰后EPCs细胞群以及野生型EPCs活性的影响,将5-FC系列稀释后加入培养基中作用72h,发现两者对5-FC的反应有明显差异。当5-FC系列稀释浓度在0.001～1000μg/ml时,对野生型EPCs无明显毒性作用,但是5-FC为10μg/ml时,经基因修饰的EPCs群的存活率就已低于50%,100μg/ml时细胞大部分死亡而仅有6%存活。据此,我们将100μg/ml作为旁效应研究中的5-FC给药浓度。在旁效应观察实验中,我们将基因修饰的EPCs群和胶质瘤细胞U251按不同比例混合后共培养,培养基中加入100μg/ml 5-FC,72小时后观察细胞生长抑制率。发现各种混合比例组的细胞生长抑制率皆大于基因修饰型EPCs群所占的比例,提示有旁效应发生,且旁效应随着基因修饰型EPCs群比例的增加而放大。当基因修饰型EPCs群与U251比例为1:1时,旁效应明显,细胞生长抑制率高达80%以上。综上,在本研究中我们成功分离、扩增并鉴定了人外周血来源的EPCs。经脂质体法转导了CD-UPRT的EPCs细胞群有效表达CD-UPRT mRNA,并可增强前药物5-Fc对基因转导细胞的细胞毒作用。旁效应实验中,证明了旁效应随基因修饰型EPCs在U251细胞中的混入比例增加而扩大;50%的基因修饰EPCs群所引发旁效应就足以杀死大部分细胞,细胞生长抑制率高达80%以上。至此,我们本研究为转导了自杀基因CD-UPRT的人外周血来源的EPCs治疗恶性胶质瘤奠定了体外实验基础。