牛肠道病毒是小RNA病毒科肠道病毒属的成员之一,外观呈球形,正二十面体结构,无包膜,大小约为25~30nm,病毒的基因组为不分节段的单股正链RNA,全长7.5kb。BEV第一次由Kunin和Mcferran在1957年从健康牛群的粪便中分离得到,随后全世界陆续报道了该病毒分离株,但在我国有关该病毒的流行病学调查报道甚少。牛肠道病毒的宿主嗜性比较广泛,包括羊、犬、人等,目前为止该病毒的病原学研究并不明确,致病机理仍不清楚,临床症状有时会出现腹泻、繁殖障碍性疾病等,有时也侵入其它器官引起临床综合征。本研究以本实验室分离鉴定并保存的BEV-3531株基因序列为参考序列设计针对3D基因的特异性引物,采用PCR方法扩增得到3D基因,扩增产物克隆到p EASY Blunt Simple Vector(p Bs K),进行测序验证。验证该序列为目的片段后,将其克隆到表达载体p ET-30a,重组质粒转化至Rosetta,经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示重组蛋白在大肠杆菌中高效表达,以Ni-NTA柱亲和层析法纯化蛋白,表达产物经初步纯化后,以3D免疫家兔获得了高效价多克隆抗体,通过Western blotting与间接免疫荧光结果得出3D蛋白具有很好的抗原性。将纯化好的3D蛋白作为包被抗原,建立了BEV-3D-ELISA方法并进行了标准化,通过重复性与特异性试验结果证明本研究建立的I-ELISA特异性、稳定性良好。在此基础上,应用本方法对哈尔滨市送检的425份奶牛血清进行了检测,结果显示3D蛋白与感染牛群血清可以发生特异性反应且阳性率高达41.41%。为了揭示动物感染牛肠道病毒后体内的3D抗体水平与病毒存在的相关性,利用BEV-3D-ELISA方法检测BEV-3531株病毒感染乳鼠后的3D抗体消长规律,同时用RT-PCR检测感染鼠肠组织中的病毒核酸;另外,用建立的BEV-3D-ELISA方法检测了哈尔滨市某奶牛群第一批血清样本42份,同时将42份相应奶牛的粪便样品进行处理后接种于MDBK细胞并观察病变情况,然后对发生病变的细胞上清进行RT-PCR、连接、转化与序列测定,最后将病变的样品通过扫描电镜进行病毒形态学鉴定;为了防止上述试验的偶然发生性又对哈尔滨市同一牛群的血清与粪便样品22份进行了相同试验。结果表明动物感染试验中感染动物体内可检测出病毒的时间范围与3D抗体存在的时间范围符合性良好,都是呈现先上升再降低的趋势;BEV-3D-ELISA临床检测结果显示第一批42份血清中10份为阳性,第二批22份血清中4份为阳性,RT-PCR结果显示第一批粪便样品中9份为阳性,第二批粪便样品中4份为阳性,二者阳性符合率分别为90%和100%,且测序结果与病毒形态学分析结果均表明得到的病毒为牛肠道病毒,证实BEV 3D抗体的可检测时期与病毒核酸可检测时期符合性良好。通过上述所有试验得出,BEV-3D-ELISA方法可以筛选出感染牛肠道病毒的阳性个体,进一步进行病原分离,也说明此方法在牛肠道病毒病原学调查应用中具有良好的前景。