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猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhoea virus,PEDV),为单股正链RNA(ssRNA)病毒,属于I型冠状病毒科成员,对各年龄段猪均易感,对7日龄仔猪致死率高达100%。近年来,变异型PEDV的暴发对养猪业造成了严重的影响。病毒在感染细胞后能够引起细胞内多种信号通路发生变化,其中PI3K/AKT/GSK-3信号通路在调控病毒感染时发挥了重要作用,其中,GSK-3的下游底物β-catenin,能被GSK-3磷酸化而降解,在病毒转录调控的过程中发挥重要的作用。本实验室前期试验结果显示:PI3K/AKT/GSK-3信号通路的激活能够抑制PEDV在Vero细胞上的增殖。为进一步探索PEDV复制增殖的分子机制,本研究采用抑制剂抑制和真核表达载体过表达等方法,探究PI3K/AKT/GSK-3信号通路及下游信号因子对PEDV复制增殖的影响。本试验研究内容结果如下:1.PEDV感染Marc-145细胞后,AKT在丝氨酸473(Ser473)位点的磷酸化蛋白水平增加,GSK-3α/β(Ser21/9)磷酸化蛋白水平增加;同时,β-catenin含量增加。用PI3K特异性抑制剂LY294002抑制其活性后,AKT(Ser473)磷酸化被抑制,GSK-3α/β(Ser21/9)磷酸化水平降低,β-catenin含量也降低(表明GSK-3活性增加),PEDV在Marc-145细胞上的增殖受到抑制。试验结果表明:PI3K/AKT信号通路的激活能够促进PEDV在Marc-145细胞中的增殖。2.用抑制剂CHIR-99021在Marc-145细胞上抑制GSK-3活性后,β-catenin含量增加,病毒在Marc-145细胞上的复制受到抑制。该研究结果显示:GSK-3在活性降低后,能够使β-catenin含量增加从而抑制病毒的增殖。N蛋白是病毒的核衣壳蛋白,它对病毒复制、转录和翻译过程均有影响,在病毒复制增殖的过程中发挥重要的调节作用。为进一步了解并阐明GSK-3调控PEDV增殖的分子机制,我们在抑制GSK-3活性后的细胞上过表达p3×Flag-N真核表达质粒,发现在293T细胞及Marc-145细胞上加抑制剂后N蛋白表达量减少,而在Vero细胞上N蛋白表达增多。3.在Marc-145细胞上,用抑制剂Salinomycin抑制Wnt/β-catenin通路后,β-catenin的含量明显降低,而病毒的复制增多。该研究结果表明:β-catenin的增加起到抑制病毒复制增殖的作用。为进一步探究β-catenin是否对PEDV N蛋白的复制产生影响,本试验将构建好的真核表达质粒p3×Flag-β-catenin和p3×Flag-N共转染到293T细胞。研究结果发现:β-catenin对N蛋白的表达具有明显的抑制作用。综上所述,一方面,PEDV感染Marc-145细胞后,能够通过激活PI3K/AKT信号通路促进病毒增殖。另一方面,PI3K/AKT信号通路激活后能够通过抑制GSK-3的活性,使细胞内β-catenin表达量增加,进而通过抑制N蛋白的表达发挥抑制病毒增殖的作用。