TLR4在C3H/HeJ小鼠军团菌感染模型中的作用

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目的1.建立军团菌感染的小鼠模型,探讨TLR4与军团菌感染的关系。2.通过比较TLR4蛋白及其信号转导通路中相关细胞因子的表达,初步阐明TLR4在军团菌感染中的作用机制。方法1. TLR4基因突变型小鼠C3H/HeJ小鼠、C3H/HeN小鼠作为实验动物,6-8周,每组8只,雌雄各半。设立C3H/HeJ染菌组、C3H/HeN染菌组、C3H/HeN对照组三个实验组。C3H/HeN对照组作为C3H/HeJ染菌组、C3H/HeN染菌组的共同对照组。染菌组气管注射50ul1.2×10~7cfu/ml军团菌菌悬液,对照组气管注射50ul无菌生理盐水,分别于染菌后12小时、24小时、48小时、72小时处死小鼠。2.处死小鼠前采集眼眶血约2ml,用流式细胞术检测各组PBMC TLR4蛋白的表达量,分析三组各时间点TLR4蛋白表达水平的变化。处死小鼠后,取染菌组和对照组的小鼠每个时间点左肺上叶约0.02g固定做病理切片;3.将剩余肺组织匀浆,用酶联免疫吸附法检测各组肺组织中TNF-α和IL-1β的含量。结果①C3H/HeJ小鼠和C3H/HeN小鼠进行生存实验时,C3H/HeJ小鼠的病死率高于C3H/HeN小鼠,两组的病死率未发现差异(χ~2=0.686,P=0.408)。肺组织病理切片显示C3H/HeJ和C3H/HeN染菌组均有炎性细胞浸润并出现肺泡血管出血现象,对照组未发现有炎症反应。C3H/HeJ染菌组、C3H/HeN染菌组和C3H/HeN对照组之间肺脏脏器系数差异有统计学意义(F=3.765,P=0.028),各个时间点之间差异没有统计学意义(F=2.296,P=0.084)分组和时间点之间交互作用差异有统计学意义(F=3.509,P=0.004)。C3H/HeJ染菌组和C3H/HeN染菌组的脏器系数均高于C3H/HeN对照组。②三组的TLR4蛋白水平表达有统计学差异(F=10.736,P<0.001),各个时间点差异有统计学意义(F=55.034,P<0.001)分组和时间点之间交互作用差异有统计学意义(F=8.094,P<0.001)。两两比较后,除C3H/HeN染菌组与C3H/HeN对照组差异无统计学意义外,其余各组间均有统计学意义(P<0.05)。基因突变小鼠C3H/HeJ染菌组TLR4蛋白表达相对较低,在24小时达到高峰后下降; C3H/HeN染菌组及C3H/HeN对照组TLR4蛋白表达随着时间的延长而下降。③C3H/HeJ染菌组、C3H/HeN染菌组、C3H/HeN对照组之间TNF-α浓度差异具有统计学意义(F=47.215,P<0.001),三组在4个时间点的比较也具有统计学差异(F=21.373,P<0.001),分组和时间点之间存在交互作用(F=2.816,P=0.021)。C3H/HeJ染菌组和C3H/HeN染菌组各个时间点TNF-α的分泌水平均高于C3H/HeN对照组,三组TNF-α浓度均在感染24小时达到高峰后开始下降。三组肺组织IL-1β浓度差异具有统计学意义(F=64.566,P<0.001),各个时间点的比较也具有统计学差异(F=13.958,P<0.001),分组和时间点之间的交互作用有统计学意义(F=3.958,P=0.005)。C3H/HeJ染菌组IL-1β的分泌水平均高于另外两组,C3H/HeJ染菌组和C3H/HeN染菌组的IL-1β浓度均在染菌后24小时达到高峰后开始下降,C3H/HeN对照组IL-1β的分泌水平随着时间的延长而上升。结论①C3H/HeJ小鼠和C3H/HeN小鼠进行生存实验病死率没有差异,染菌后肺组织均出现炎症反应,提示二者对军团菌的易感性相同。②C3H/HeN染菌组PBMC TLR4蛋白的表达水平高于C3H/HeJ染菌组,C3H/HeN染菌组与C3H/HeN对照组的TLR4蛋白表达水平没有差异,提示TLR4可能未参与军团菌的抗感染作用。C3H/HeJ染菌组TLR4蛋白的表达水平于染菌24h后达到高峰,可能是其它TLR受体对TLR4的补偿作用。③C3H/HeJ染菌组、C3H/HeN染菌组TNF-α、IL-1β浓度均高于对照组,提示军团菌感染后可能通过上调了TNF-α和IL-1β的表达水平来发挥抗菌作用。
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