胃癌是常见的恶性肿瘤之一,在全球范围内,胃癌死亡率居恶性肿瘤死亡率的第二位。在我国,胃癌的死亡率曾长期位居各恶性肿瘤之首。因此,胃癌的生物学特性及治疗方法一直是国内外学者研究的热点,特别是肿瘤组织中淋巴管与血管的研究,颇受关注,已经取得了较为公认的结果,但关于肿瘤内神经的研究却很少得到关注。在很长一段时间内,医学界曾认为肿瘤组织内不存在神经支配,然而,随着科学技术的发展和医学实验技术的提高,不断有学者报道在肿瘤组织内发现神经纤维的存在。有研究发现其不同于正常组织内的神经纤维,并分散走行于胃癌细胞之间,因而推测肿瘤内神经纤维的存在不仅仅是肿瘤在生长过程中包裹原有胃壁组织中神经纤维的结果,很有可能存在新生的神经纤维。电镜下观察,发现神经纤维通过膨体与癌细胞直接接触。在我实验室前期的研究中,我们发现在胃癌组织内可见大量P-ERK1/2免疫阳性反应的神经纤维,呈束状或串珠状走行,并可见呈巢状分布的P-ERK1/2免疫阳性反应细胞。神经纤维主要分布在P-ERK1/2免疫阳性细胞的四周并与这些细胞相毗邻。在胃癌组织有大量表达神经生长因子(NGF)的细胞,体外培养的低分化胃癌细胞系(MNK45)高表达神经生长因子(NGF)。然而,在肿瘤组织这样一个特殊的微环境下,神经发挥了怎样的作用,肿瘤对神经的生物学行为构成了怎样的影响,其相互作用与肿瘤的分化程度,肿瘤的转移,与患者的年龄、性别、预后是否具有相关性等问题尚缺乏相关的研究。本实验旨在前人研究的基础上进一步探讨肿瘤分化程度与肿瘤组织中神经分布的相关性,并从细胞水平探讨肿瘤细胞与神经细胞之间的相互作用与影响。一、正常胃组织与胃癌组织内神经分布密度的比较目的:比较正常胃组织与胃癌组织内神经分布密度及神经形态的差异。方法:取66例胃癌患者活体手术切除的胃癌组织标本及正常组织标本,对每位患者的正常组织和癌组织切片进行比较。用GAP-43对神经纤维进行免疫组化染色,显微镜下观察胃癌组织和正常胃组织内神经纤维的密度及形态差异。Image-pro plus 6.0图像分析系统在相同的系统条件下进行GAP-43免疫阳性神经纤维分布密度的分析。运用SPSS软件进行统计学分析,P<0.05有统计学意义。结果:在正常胃组织内可见大量GAP-43免疫染色阳性的神经纤维,在黏膜层中,神经纤维走行于胃黏膜腺体之间,与黏膜下的毛细血管和毛细淋巴管相伴行,在黏膜下层中,神经纤维分布于环行肌层和粘膜之间,神经纤维交汇融合成神经纤维网,并可见神经纤维束,神经纤维在肌层中散在分布于外纵行肌层和内环行肌丛,其分布密度较高,为22854±4024。胃癌组织中亦存在GAP-43免疫染色阳性的神经纤维,但神经纤维的分布范围局限于胃癌组织的边缘和被胃癌浸润的胃组织内,纤维密度明显低于正常胃组织,其形态和神经走行均失去正常胃组织内所具有的形态和走形,其分布密度较低,为12586±892,其差异具有统计学意义(P<0.05)。在检测的66例患者标本中,所有癌组织内均有神经纤维分布,阳性率达100%,且所有患者癌组织中的神经纤维密度均低于正常组织。结论:胃癌组织内存在神经纤维的分布,其形态、走行与正常胃组织中的神经纤维有所不同,分布密度明显低于正常胃组织。二、高分化与低分化胃癌组织中神经纤维分布密度的比较目的:比较不同分化程度的胃癌组织中神经纤维分布密度的差异,寻找胃癌分化程度与胃癌组织中神经纤维分布密度的相关性。方法:分别在28例高分化与38例低分化胃癌患者的活体手术切除标本的癌组织中心位置取材,进行GAP-43免疫染色,显微镜下观察高分化与低分化胃癌组织内神经纤维分布密度的差异,及神经纤维的形态及走行。Image-pro plus 6.0图像分析系统在相同的系统条件下进行GAP-43免疫阳性神经纤维分布密度的分析。运用SPSS软件进行统计学分析,P<0.05有统计学意义。结果:低分化胃癌组织内神经纤维分布密度为17024±857,高分化胃癌组织内神经纤维分布密度为10323±912。其差异具有统计学意义(P<0.05)。本实验中未见不同分化程度的胃癌组织中神经纤维的形态及走行具有明显差异。结论:低分化胃癌组织内神经纤维分布密度高于高分化胃癌组织内神经纤维分布密度,其形态、走行未见明显差异。三、高分化与低分化胃癌患者正常胃组织中神经纤维分布密度的比较目的:比较不同分化程度的胃癌患者正常胃壁组织中神经纤维分布密度的差异。方法:分别取28例高分化与38例低分化胃癌患者活体手术切除标本距癌组织5cm以远处正常胃壁组织,进行GAP-43免疫染色,显微镜下观察其神经纤维分布密度及形态、走行。Image-pro plus 6.0图像分析系统在相同的系统条件下进行GAP-43免疫阳性神经纤维分布密度的分析。运用SPSS软件进行统计学分析,P<0.05有统计学意义。结果:高分化胃癌患者正常胃壁组织内神经纤维分布密度为23862±4895,低分化胃癌患者正常胃壁组织内神经纤维分布密度为20237±3794。其差异无统计学意义(P>0.05)。结论:胃癌患者正常胃壁组织内神经纤维分布密度与胃癌的分化程度无关。四、MKN28 / MKN45细胞条件培养液对PC12细胞增殖的影响目的:研究MKN28(高分化胃癌细胞系)/ MKN45(低分化胃癌细胞系)对PC12(肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系)增殖的影响,并比较其差异。方法:将复苏后的第三代MKN28 / MKN45进行梯度降血清培养,并在低血清条件下培养12h后,加入维生素C,促进其分泌。每4h换液一次,分别收集其上清液,并用于培养PC12细胞。共分三组对PC12细胞进行培养:MKN28组,MKN45组和普通培养液组。MTT法分别检测PC12细胞在1,3,5,7d的细胞增殖状况。运用SPSS软件进行统计学分析,P<0.05有统计学意义。结果:MKN28组与MKN45组PC12细胞增殖率在第3、第5天均高于普通培养液组,MKN45组PC12细胞增殖率在第3、第5天高于MKN28组。结论:MKN28与MKN45胃癌细胞均能促进PC12细胞系的增殖。相比之下,MKN45具有更强的促进增殖能力。五、PC12细胞条件培养液对MKN28 / MKN45细胞增殖的影响目的:研究PC12对MKN28/ MKN45增殖的影响。方法:将复苏后的第三代PC12细胞进行梯度降血清培养,并在低血清条件下培养12h后,加入维生素C,促进其分泌。每4h换液一次,收集其上清液,并用于培养MKN28 / MKN45细胞。分别采用普通培养液培养作为各自的对照组。MTT法分别检测MKN28 / MKN45细胞在第1,3,5,7d的细胞增殖状况。运用SPSS软件进行统计学分析,P<0.05有统计学意义。结果:PC12对MKN28增殖的影响:在第3、第5、第7d条件培养液组MKN28的细胞增殖率均高于普通培养液组。PC12对MKN45增殖的影响:在第3、5d条件培养液组MKN45的细胞增殖率均高于普通培养液组。结论:PC12细胞对高、低分化胃癌细胞均具有促进增殖的作用。六、PC12-MKN28 / PC12-MKN45混合细胞团裸鼠体内移植检测癌细胞对神经细胞增殖的影响目的:研究MKN28 / MKN45在体内对PC12增殖的影响。方法:PKH26荧光标记PC12细胞,分别与MKN28、MKN45均匀混合,用胶原明胶制备PC12-MKN28细胞团与PC12-MKN45细胞团。每种细胞团内PC12细胞数量均为1×10~6个,MKN28 / MKN45为1×10~7个。取10只裸鼠,将细胞团移植于裸鼠双侧下腹壁皮下组织内,6w取材,观察细胞团大小,重量。HE染色,观察细胞形态,荧光显微镜下观察细胞团中PC12细胞增殖状况。结果:PC12-MKN45细胞团体积普遍大于PC12-MKN28细胞团。荧光显微镜下观察,PC12-MKN45细胞团中PC12细胞密度较高。结论:在体内,PC12-MKN45细胞团增殖较快;MKN45促进PC12增殖的能力更强。