牙周韧带细胞(Periodontalligamentcells，PDLCs)是一个包含了处于不同分化方向和分化阶段的异质性细胞群，最近的研究提示PDLCs中存在成体干细胞，可以再生牙周组织，牙周韧带干细胞成骨分化是其作为组织工程种子细胞的一个重要的功能表现。目前，对PDLCs的干细胞成分特征及其成骨分化的蛋白调控机制还不清楚。深入研究PDLCs的生物学特性，明确其干细胞成分特征，发现其潜在的分化标记和分化机制，对充分利用牙周韧带干细胞进行治疗具有重要意义。本研究分离培养PDLCs，对其生物学特性和多向分化能力进行分析，以明确牙周韧带细胞中的干细胞成分特征，建立PDLCs诱导成骨分化的差异表达蛋白质数据库，探讨PDLCs诱导成骨分化的分化标记和蛋白质调控机制。 本研究包括以下三部分。 第一章人牙周韧带细胞的生物学特性研究 目的：分离和培养人PDLCs，观察其增殖能力、细胞周期、表型特征、多向分化等，以明确PDLCs的干细胞成分和分化潜能。 方法：选取年轻患者因正畸拔除的前磨牙和第三恒磨牙，刮取牙根中1/3的牙周韧带组织，采用I型胶原酶和Dispase联合酶消化法分离培养获得PDLCs，通过倒置显微镜观察细胞生长情况；细胞计数与MTT法描记细胞生长曲线；流式细胞仪检测细胞周期；免疫组织化学和流式细胞仪检测细胞表面抗原表达；矿化液、软骨细胞和脂肪细胞诱导液分别诱导PDLCs向成牙骨质/成骨样细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化，组织染色、免疫组织化学和RT-PCR检测其多向分化能力。 结果：培养的人PDLCs生长旺盛，低密度接种形成细胞克隆。计数法和MTT法均显示第2代细胞生长曲线接近“S”形。体外连续培养10代的PDLCs具有较高比例的G0/G1期，平均为86.61％，增殖系数PI平均为13.08％，自第6代开始P1逐渐下降。免疫组化染色显示细胞角蛋白阴性，波形丝蛋白染色阳性，间质干细胞表面抗原STRO-1、CD-146染色阳性。流式细胞仪检测PDLCs的表面抗原显示：三组不同来源的第二代PDLCs的STRO-1、CD-146、CD29、CD44、CD106和CD34的阳性表达平均值分别是14.4％、51.3％、99.9％、99.8％、76.8％和0.1％。连续培养后，STRO-1和CD-146的阳性表达百分比随传代逐渐下降。PDLCs诱导成骨分化21天后形成Vonkossa和茜素红染色阳性结节。PDLCs诱导向软骨细胞分化21天后，显示有大量的胞外基质糖胺多糖GAG合成，免疫组化检测II型胶原阳性表达。PDLCs诱导向脂肪细胞分化21天后，油红O染色见脂肪细胞和脂滴形成：RT-PCR检测发现脂肪细胞特有的转录子PPARγ2和LPLmRNA的表达显著增加。 结论：本研究从细胞生长与增殖、表型特征和多向分化潜能等方面证实PDLCs中存在成体干细胞，提示牙周韧带来源的PDLCs可以作为牙周组织再生种子细胞的新来源，PDLCs诱导成骨分化实验为进一步研究其成骨分化标记和分化机制提供了可行的体外研究模型。 第二章牙本质涎蛋白在人牙周韧带细胞成骨分化过程中的表达 目的：研究成牙本质细胞相对特异性蛋白DSP和DSPPmRNA在人PDLCs向成牙骨质/成骨样细胞分化过程中的表达模式及可能的功能作用。 方法：诱导PDLCs成骨分化过程中，检测ALP活性表达模式；免疫组化和Westernblot检测DSP和OCN的表达；RT-PCR检测DSPP和OCNmRNA的表达模式。 结果：PDLCs诱导培养前，OCN免疫染色阳性，诱导培养14天，OCN和DSP染色阳性。Westernblot显示：PDLCs诱导前表达OCN，随诱导时间延长，表达OCN增加。PDLCs诱导前不表达DSP，诱导14天后，发现阳性条带，随PDLCs诱导时间延长，阳性条带密度增强。随诱导时间延长，ALP活性上调，诱导14天和21天组ALP活性均较对照组有显著性差异，p<0.05。RT-PCR结果显示：未诱导培养的人PDLCs表达相对较低的OCN和DSPPmRNA，随成骨诱导时间延长，OCN和DSPPmRNA表达上调，各诱导组与对照组之间均有显著性差异，p<0.05。 结论：本研究进一步证实PDLCs在体外能够分化形成成牙骨质/成骨样细胞，发现人PDLCs成骨分化过程中，表达DSP蛋白和DSPPmRNA，与ALP活性和OCN及其mRNA表达模式一致，提示DSP/DSPP参与调节PDLCs向成牙骨质/成骨样细胞分化，DSP/DSPP有可能与ALP和OCN一起作为PDLCs向成牙骨质/成骨样细胞分化的标记。 第三章人牙周韧带细胞成骨分化的差异蛋白质组学研究 目的：比较人PDLCs成骨分化过程中蛋白质组的差异表达，建立PDLCs诱导成骨分化的差异表达蛋白数据库，探讨PDLCs诱导成骨分化的分化标记和蛋白质调控机制。 方法：通过胶内差异双向电泳结合质谱鉴定、数据库设置与检索系统等蛋白质组学技术研究PDLCs诱导成骨分化7天的差异表达蛋白质；Westernblot验证部分差异表达蛋白质。 结果：获得PDLCs诱导成骨分化7天的差异表达蛋白质图谱，经统计分析，共确认差异大于1.5倍的蛋白质斑点61个，质谱鉴定确认29个蛋白质。根据蛋白质的功能将其分为：细胞骨架蛋白及细胞骨架蛋白相关蛋白，核蛋白和其它蛋白。其中细胞骨架蛋白及细胞骨架蛋白相关蛋白包括Vimentin、CaD、betatropomyosin、skeletalmuscletropomyosin、CHC、AnnexinA4和相关激酶PAK65参与调节细胞骨架改建和信号传导，影响细胞形态、增殖和迁移，提示这些蛋白在PDLCs成骨分化过程中发挥潜在的功能作用且调节作用相似。核蛋白hnRNPC、NPM1和1aminA/C可能调节PDLCs的细胞周期和向成骨细胞分化。其它蛋白包括转谷氨酰胺酶、1-ERBB2、弹性微纤维交界子3、真核蛋白(SGT1Bprotein)、真核转化延长因子1δ同形体1、储铁蛋白、网织体先驱、免疫调节剂Clq-C、H链和A链等蛋白以及一些未命名蛋白。CaD和hnRNPC的差异表达经Westernblot进一步得到验证。 结论：本研究建立了PDLCs成骨分化的差异蛋白质组数据库，从整体水平探讨PDLCs诱导成骨分化的分化标记和蛋白质调控机制，为进一步揭示PDLCs成骨分化机制及相关蛋白功能作用提供新的实验依据。