Gp96是热休克蛋白HSP90家族一员,具有多种免疫学效应,包括提高抗原呈递、刺激抗原呈递细胞(APCs)产生细胞因子、激发机体特异性免疫应答及细胞毒性T细胞(CTL)反应,以及免疫佐剂效应。本论文主要研究猪Gp96N对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的B、T细胞表位合成肽疫苗、B细胞表位串联亚单位疫苗以及猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)灭活疫苗的免疫佐剂效应。首先建立了表达猪Gp96N的大肠杆菌和毕赤酵母p.pastoris-X33表达系统,利用纯化的猪Gp96N作为免疫佐剂,在小鼠和猪上,从细胞免疫、体液免疫和天然免疫角度,分析了猪Gp96N对上述三种疫苗的免疫增强效应。研究结果为猪Gp96N作为免疫佐剂在疫苗中的应用提供了科学依据。从猪肾脏中提取RNA,采用RT-PCR扩增得到猪Gp96N基因cDNA片段,分别插入载体pET-32a和pPICZαA中,构建出原核表达载体pET-32a/Gp96N和真核表达载体pPICZaA/Gp96N,分别转入大肠杆菌BL21和毕赤酵母p.pastoris-X33中,经抗性筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET-32a/Gp96N和重组毕赤酵母p.pastoris-X33/pPICZaA/Gp96N。对表达产物进行纯化,获得猪Gp96N蛋白。根据文献报道,筛选出PRRSV的结构蛋白和非结构蛋白的高度保守B细胞和T细胞抗原表位,经化学合成表位多肽,与猪Gp96N联合免疫小鼠和猪。结果发现,猪Gp96N能够增强表位肽诱导的特异性体液免疫和细胞免疫应答；猪Gp96N能显著上调IL-12和TNF-a,下调IL-4和IL-10的表达水平；用PRRSV高致病性毒株JXwn06对免疫猪的攻毒试验结果表明,表位多肽+猪Gp96N (BT-Gp组)免疫猪在攻毒后第7天全部死亡,表位多肽免疫(BT组)猪在第5天全部死亡,而对照组(PBS组和猪Gp96N组)的猪在攻毒后第3天全部死亡。虽然BT-Gp组和BT组的免疫猪均不能抵抗JXwn06的攻击,但比较攻毒后猪体温、临床症状、血清中病毒滴度等发现,在PRRSV攻毒后7天内,猪Gp96N与表位多肽联合使用能在一定程度上缓解猪的临床症状,降低猪血清中的病毒载量。将一些PRRSV的结构蛋白和非结构蛋白Nsp2的高度保守B细胞抗原表位通过柔性linker连接,利用重叠PCR技术获得融合基因,并将其重组到原核表达质粒中,经过大量表达和纯化后得到串连多B细胞表位亚单位疫苗(Cpl、Cp2)。以猪Gp96N为免疫佐剂,与Cpl、CP2联合免疫小鼠和猪。经过三次免疫后,采用ELISA检测小鼠和猪血清中的抗体。结果表明,免疫小鼠和猪血清中均可检测到PRRSV特异性抗体,且猪Gp96N能提高抗体滴度3-4倍；从免疫小鼠血清中可检测到中和抗体,但在猪血清中未检测到中和抗体；ELISPOT及淋巴细胞增殖试验结果表明,猪Gp96N能显著提高疫苗诱导的细胞免疫。此外,定量ELISA检测发现,猪Gp96N能显著上调猪血清中IFN-γ, IL-12等Th1型细胞因子以及TNF-α的表达水平,同时能够下调IL-4和IL-10的表达水平。用不同剂量的猪Gp96N与PCV2灭活疫苗联合免疫猪,采用ELISA检测免疫前后各组血清中PCV2特异性抗体IgG以及IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子含量。结果发现,与单独免疫PCV2灭活苗及商业化的亚单位疫苗相比,猪Gp96N能够提高特异性抗体IgG水平,且随着Gp96N剂量增加,IgG水平呈递增趋势,表明猪Gp96N能够增强PCV2灭活疫苗的体液免疫。此外,与单独免疫疫苗相比,猪Gp96N+PCV2灭活疫苗联合免疫,能提高免疫猪的IFN-γ、TNF-α水平,但对1L-1β、IL-6没有影响。综上研究结果表明,猪Gp96N在一定程度上能够增强PRRSV亚单位疫苗的体液和细胞免疫应答,提升PCV2灭活疫苗的体液免疫效果,具有潜在的免疫佐剂效应。