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研究背景及意义乳腺癌是当今严重威胁女性健康和生命的常见恶性肿瘤之一。在我国,乳腺癌发病率逐年上升,尤其在某些地区其发病率甚至位居女性恶性肿瘤的首位,且发病年龄趋于年轻化。乳腺癌为一种富含血管的恶性肿瘤,与大多数肿瘤相似,它的发生、发展是由外界环境、遗传基因等多种因素导致的多基因、多阶段的过程。其病因和预后因素尚不完全明确。业已证实,肿瘤血管的新生是导致肿瘤复发、转移的重要因素。早在20世纪70年代,Folkman等人率先提出肿瘤生长依赖新生血管的生成,并阐明了乳腺癌肿瘤血管生成的机制：肿瘤血管生成,实质上就是促血管生成因子与抑制血管生成因子平衡被打破的过程。从生物学的角度来看,血管生成调节蛋白已被确定为调节乳腺肿瘤生长的重要蛋白,它作用于肿瘤发生、发展的整个过程,因此被认为是较为理想的诊断及治疗靶点。血一小板在止血、组织修复、维护血管内皮细胞和血管张力过程中发挥重要作用,而事实上,肿瘤即可视为无法愈合的伤口。血小板对肿瘤发展的积极作用是目前一个新兴的研究领域。血小板存在多种血管生成调节蛋白,生理条件下,这些蛋白的相对浓度保持稳定,而当肿瘤存在时,它们的水平会发生显著变化。研究已发现在肿瘤患者的血浆和组织中存在多种血管生长调节蛋白水平升高的现象,然而,令人感兴趣的是,最近很多文献报道许多血管生成调节蛋白在荷瘤动物外周血小板中的浓度远远高于血浆、血清或非恶性肿瘤,且血小板中该类蛋白升高明显早于血浆或组织。因此,我们推测血小板血管调节蛋白可能比血浆中调节蛋白更敏感的反映肿瘤的发生、发展。本课题研究旨在探讨血管调节相关蛋白在乳腺癌患者外周血小板及肿瘤组织中的表达及其与临床病理特征的相关性,试图发现这类蛋白对乳腺癌早期诊断及预后的影响,从而更准确的评估预后,更好的指导临床治疗。本研究分为两个部分。第一部分研究目的：血小板能够促进肿瘤血管生成和生长,也负责多种血管生成调节蛋白的转运。本研究旨在探讨乳腺癌患者循环血小板内血管生成调节蛋白的表达水平及其在乳腺肿瘤发生、发展以及预后方面的价值。研究方法：采集聊城市人民医院37例乳腺癌患者及65例正常人群4mL静脉血血样,排除既往有血小板功能紊乱和服用影响血小板功能药物史的患者。应用Bergers法常规进行全血中血小板的分离,分别收集血小板颗粒(PP)和贫血小板血浆(PPP),利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF-BB)、凝血酶敏感蛋白1(TSP-1)、血小板因子4(PF4)和转化生长因子β1(TGF-β1)及肌动蛋白(Action)的含量,同时利用肌动蛋白的水平标准化血小板的蛋白质水平,从而控制血小板数量的偏离。研究结果：VEGF、PDGF-BB、PF4、TGF-β1在乳腺癌患者血小板中的表达明显高于正常组(VEGF2.1pg/106platelets vs.0.9pg/106platelets, PF421.2n/106platelets vs.10.2ng/106platelets,PDGF-BB42.9pg/106platelets vs.19.1pg/106platelets,TGF-β115.3ng/106platelets vs.4.3ng/106platelets,P<0.001),而在贫血小板血浆中它们的表达无显著差异(P均>0.05)。乳腺癌患者血小板中血管生成相关蛋白VEGF、PDGF-BB、PF4、TGF-β1的ROC曲线下面积分别为0.789、0.856、0.735、0.763,均大于0.7。而且,血小板中VEGF,PDGF和TGF-β1蛋白浓度与临床分期晚、有淋巴结转移、Her-2(+)型及basal-like型的分子分型等临床病理学特征也具有相关性(P<0.05),这些临床特征多提示预后较差。研究结论：血管生成相关蛋白PF4、VEGF、PDGF-BB和TGF-β1在乳腺癌血小板中高水平表达,联合检测血小板中这些蛋白可能比血浆中调节蛋白更敏感的反映乳腺癌的发生、发展。血小板中VEGF,PDGF和TGF-β1水平可能与乳腺癌的预后相关。第二部分研究目的：肿瘤血管生成对于乳腺癌细胞的生长和扩散是必需的,因此本研究旨在探讨血管生成调节蛋白PDGF-BB,TGF-β1和VEGF在乳腺癌肿瘤组织中的表达,并与血小板颗粒中蛋白表达进行相关性分析,初步探讨上述蛋白可能在乳腺癌的发生、发展中发挥重要作用。研究方法：收集2011-2013年聊城市人民医院病理科的80例乳腺浸润性导管癌及53例癌旁蜡块组织存档标本,均为第1次手术,术前未接受过肿瘤辅助放化疗及内分泌治疗。所有样本均分别通过SP法免疫组化染色进行VEGF、 PDGF-BB蛋白及TGF-β1蛋白表达水平的检测,CD34标记的微血管密度(MVD)检测亦是采用SP法免疫组化染色进行。研究结果：VEGF、PDGF-BB和TGF-β1三者蛋白在80例乳腺癌组织中表达,阳性率分别为76%、68%及81.9%,明显高于癌旁组织(P均<0.05)。VEGF蛋白表达水平与乳腺癌的临床分期、淋巴结状态、ER阳性表达、MVD等呈正相关。TGF-β1在临床分期越晚、有淋巴结转移、MVD越高的乳腺癌组织,蛋白阳性表达率显著升高,有统计学意义(P均<0.05)。PDGF-BB则与淋巴结状态、MVD等呈显著相关(P均<0.05)。80例乳腺癌患者中,吸烟组PDGF-BB, TGF-β1和VEGF表达率明显增高,表达率分别为45%、56.2%、52.5%,与非吸烟组相比,差异有明显统计学意义(P<0.05)。本研究35例乳腺癌组织中,VEGF、PDGF-BB和TGF-β1三者蛋白表达与其血小板颗粒中蛋白表达水平呈中度正相关,rs分别为0.482、0.599、0.458,P值均<0.05。研究结论：血管生成调节蛋白(VEGF、PDGF-BB和TGF-β1)在乳腺癌组织中高水平表达,与临床病理特征相关,提示此三种蛋白可能在肿瘤生长、发展中起到了重要作用,与预后相关。吸烟可提高肿瘤血管调节蛋白表达,从而促进肿瘤新生血管形成,可能参与乳腺癌的发生和转移。肿瘤组织和血小板颗粒中血管生成调节蛋白的表达水平是呈正相关,进一步证实检测血小板血管生成调节蛋白具有预后预测的的临床意义。