研究背景和目的下咽鳞状细胞癌(HSCC)是头颈部肿瘤中相对预后最差的恶性肿瘤,严重威胁人类生命健康,总的5年生存率在25%-40%。尽管目前下咽癌的诊疗手段在不断改进,包括手术切除肿瘤、放疗、化疗及靶向治疗等,但下咽癌病人的病死率仍居高不下。侵袭转移是造成下咽癌治疗失败和患者死亡的最主要原因。因此,充分了解下咽癌侵袭转移的分子调控机制对于下咽癌转移的早期诊断、提高患者生存率等都具有重要意义。细胞间黏附状态的改变是肿瘤转移过程中的关键环节。低水平的上皮型钙粘素(CDH1/E-cadherin)与肿瘤的转移以及病人的预后不良密切相关。另外,恶性肿瘤中存在某种因素可使MMP-9过度表达,导致基质降解,有利于肿瘤浸润转移。研究表明在头颈部鳞癌及非小细胞肺癌中CDH1表达降低能够转录激活表皮生长因子受体(EGFR),最终促进细胞增殖。EGFR是受体酪氨酸激酶(RTK)的一种,RTK可以使信号传导及转录激活因子3(STAT3)磷酸化,一旦STAT3被活化,它将会调控一系列靶基因(如MMP-9)的转录,从而影响肿瘤细胞的增殖,迁移和侵袭。然而,在下咽癌中CDH1下调影响MMP-9表达的精确分子机制并不清楚。综上所述,下咽癌转移与预后的关系密切,一旦发生转移,5年生存率较低,预后较差。因此深入研究下咽癌的转移调控机制具有重要的临床意义。CDH1功能的丧失可以影响对细胞外基质(ECM)的调节,这一机制可能与STAT3的磷酸化相关。而作为调控ECM的一种酶,MMP-9在肿瘤侵袭、转移和血管生成中起到关键的作用。目前,CDH1/STAT3/MMP-9信号通路在下咽癌中的机制尚不明确。因而,有必要对这一个分子机制问题进行深入研究。研究方法与分组1.本研究选取2010年06月至2014年12月期间在山东大学附属山东省耳鼻喉医院行根治性手术,术前未进行辅助治疗,病理及/或细胞学诊断为下咽鳞状细胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)的患者共 109 例,其中下咽癌术后肺转移患者31例,随访至少3年,获得配对肿瘤及癌旁正常上皮组织样本。研究内容主要包括患者性别、年龄、病程时间、吸烟饮酒史、临床表现、肿瘤部位、肿瘤分期、病理分级、术后是否存在远处转移,并且对术后生存时间、死亡原因等生存情况进行随访。2.免疫组化实验:以兔CDH1和MMP-9单克隆抗体为主要抗体检测CDH1和MMP-9的蛋白水平。3.细胞系为人类下咽癌FaDu细胞系。4.FaDu细胞的培养包括FaDu细胞复苏、传代培养、接种以及冻存。5.蛋白印迹实验包括细胞总蛋白的提取、考马斯亮蓝法测定蛋白浓度以及蛋白质免疫印迹法。6.FaDu细胞siRNA转染:待FaDu细胞覆盖率达到60-80%时,进行siRNA转染;siRNA 对照组靶向于 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’序列,STAT3的 siRNA 组靶向于 5’-GCAAGAUUCAGACCCUCAATT-3’序列,CDH1#1和#2的 siRNA 组 靶 向 于 5’-CAGACAAAGACCAGGACTA-3’ 序列和5’-GCACGUACACAGCCCUAAU-3’ 序列,MMP-9 的 siRNA 组靶向于5’-CAUCACCUAUUGGAUCCAA-3’序列。7.磺酰罗丹明 B(Sulforhodamine B,SRB)法:FaDu 细胞 siRNA 干预 24小时后重新接种于96孔板中继续培养48小时。进行染色、漂洗和检测吸光度值。8.细胞迁移实验:FaDu细胞siRNA转染处理48小时后,重新接种于Transwell小室中继续培养24小时,固定、染色、清洗、计数。9.细胞侵袭实验:FaDu细胞siRNA转染处理48小时后,重新接种于铺好Matrigel胶的Transwell小室中继续培养36小时,固定、染色、清洗、计数。10.CCK-8实验:使用siRNA干预FaDu细胞24小时后,制备细胞悬液并重新接种FaDu细胞到96孔细胞培养板,继续培养48小时,向每孔加入10μl的CCK-8试剂液,在培养箱中孵育2小时后,检测吸光度值。研究内容及研究成果1.CDH1表达与下咽癌转移及临床预后的相关研究1.1 CDH1与下咽鳞状细胞癌肺转移相关为了探究CDH1在HSCC进展中的作用,我们通过免疫组化(IHC)染色研究了109例患者癌及癌旁正常上皮组织中CDH1的表达水平,其中31例存在下咽癌术后肺转移。CDH1在癌组织中的阴性表达(16/109)高于癌旁正常上皮组织(5/109)(P=0.012,Mann-Whitney U 检验);与无肺转移的 HSCC 组织(5/78)相比,CDH1在存在肺转移的HSCC组织中阴性表达显著增高(11/31)(P<0.01,χ2检验);CDH1阴性表达和中等阳性或强阳性表达的差异都具有统计学意义(P<0.01,χ2检验)。我们对CDH1表达与HSCC肺转移的相关性采用Spearman秩相关系数检验,发现二者呈显著负相关(r=-0.431,P<0.01)。1.2 CDH1表达和HSCC临床预后相关单因素和多因素分析显示,CDH1的低表达与总生存时间和无病生存时间较短有关(P<0.05,log-rank检验),淋巴结转移与总生存时间较短有关(P<0.05,log-rank检验)。CDH1阴性与HSCC患者复发显著相关(P=0.001,χ2检验)。CDH1的表达与肿瘤的病理分期之间的相关性具有统计学意义(P=0.025,χ2检验)。1.3 CDH1、MMP-9 在 HSCC 中的表达我们用免疫组织化学染色法比较CDH1和MMP-9在癌旁正常上皮组织和HSCC组织中的表达情况。CDH1的表达除了明显定位于肿瘤细胞膜外,还表现出约60%的表达位于胞浆。然而,CDH1在癌旁正常上皮组织中基本只在细胞膜上表达。癌旁正常上皮组织(104/109)与癌组织中(93/109)CDH1阳性表达差异有统计学意义(P=0.012,Mann-WhitneyU检验)。我们发现在相同的HSCC样本中,CDH1表达的减少往往伴随着MMP-9表达的增加。2.CDH1表达下调诱导MMP-9表达的分子机制及功能研究2.1 CDH1表达下调诱导FaDu细胞中MMP-9表达上调我们应用siRNA处理抑制CDH1在FaDu细胞中的表达,并通过Western blot实验检测MMP-9的水平。结果表明,CDH1表达降低的FaDu细胞,MMP-9表达高于对照组。2.2 CDH1表达下调通过p-STAT3上调MMP-9我们的研究数据显示,CDH1的缺失导致p-STAT3显著增加。我们通过siRNA转染抑制STAT3和CDH1的表达,发现抑制STAT3后可以削弱CDH1下调所引起的MMP-9的表达上调。我们应用AG490处理CDH1-siRNA转染的FaDu细胞以抑制STAT3活化,发现STAT3的药理抑制作用也阻止了 CDH1缺失触发的MMP-9上调。2.3 CDH1表达下调通过STAT3和MMP-9促进FaDu细胞的增殖CDH1 siRNA处理的FaDu细胞生长增殖增强,而转染STAT3或MMP-9 siRNA的FaDu细胞生长增殖明显下降。此外,同时抑制CDH1和STAT3或MMP-9后明显减弱CDH1沉默诱导的细胞高增殖能力。2.4 CDH1表达下调通过STAT3和MMP-9提高FaDu细胞的迁移和侵袭能力与对照组相比,CDH1沉默的FaDu细胞的迁移和侵袭能力明显增强。相反,STAT3或MMP-9 siRNA处理的FaDu细胞迁移和侵袭能力明显下降。此外,沉默STAT3能够降低CDH1缺失所引起的FaDu细胞的高迁移侵袭能力。研究结论CDH1是HSCC肺转移和预后的有力预测指标,进一步的机制研究表明下咽癌细胞中CDH1表达下调通过磷酸化STAT3上调MMP-9表达进而促进下咽癌细胞的增殖和转移,最终影响HSCC的恶性发展和肺转移。我们的研究可能为HSCC肺转移提供新的治疗靶点,从而为进一步提升临床预后和开辟潜在的治疗途径提供科学依据。