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背景:全身麻醉至今已经有170年的历史,但是其作用机制还不完全清楚,目前越来越多的学者倾向于用网络调控机制解释麻醉药物的作用,认为脑内多种神经递质、调质及其投射系统与全身麻醉的产生和调控相关。本实验小组前期系列研究已经证明神经肽orexin在全麻觉醒中发挥重要作用,发现orexin可以激活结节乳头核的组胺能神经元和多巴胺、肾上腺素能神经元发挥其促麻醉觉醒的作用。有研究表明oreixn亦可以作用于激活脑干中缝背核(dorsal raphe nucleus,DRN)的5-羟色胺能(5-hydroxytryptamine,5-HT)神经元,调控如睡眠等生理功能。5-HT是一种在生物体内广泛存在的单胺类物质,参与痛觉、体温、情绪、睡眠-觉醒的调控,已有证据表明5-HT在麻醉中也有作用。本文旨在探讨异氟烷麻醉中DRN的5-HT能神经元是否参与介导orexin神经元麻醉促觉醒作用。目的:了解脑干的DRN区的5-HT能神经元在orexin异氟烷促麻醉觉醒效应中的作用和机制。实验一:DRN区微注射orexin及其受体配体对异氟烷麻醉的诱导和觉醒时间的影响方法:成年雄性SD大鼠(体重230-300g),月龄3-4m,实验前动物先在10%水合氯醛麻醉下(1ml/kg,i.p.)。(1)在DRN埋置核团微注射外套管,5-7天后进行实验。大鼠在氧流量为1.5L/min、异氟烷浓度为1MAC(1.4%)条件下进行麻醉。麻醉第15分钟时DRN区微注射orexin-A(30pmol/0.3ul,100pmol/0.3ul)或orexin-B(30pmol/0.3ul,100pmol/0.3ul),对照组注射saline(0.3ul),另外两组微注射orexinⅠ型受体拮抗剂SB334867(5ug/0.3ul,20ug/0.3ul)或Ⅱ型受体拮抗剂TCS-OX2-29(5ug/0.3ul,20ug/0.3ul),对照组给予DMSO(0.3ul)。给药15分钟后停止麻醉剂吸入,给药终止至大鼠翻正反射恢复时间为觉醒时间(emergence time)。观察记录SD雄性大鼠异氟烷麻醉的觉醒时间。(2)慢诱导法观察麻醉诱导时间:动物分组同上。上述各种试剂于给药后15分钟进行麻醉。将大鼠置入麻醉箱,氧流量设为1.5L/min,异氟烷挥发罐浓度为2%。从麻醉剂开始吸入至大鼠翻正反射消失时间为麻醉诱导时间(nduction time),记录慢诱导的诱导时间。结果:(1)与saline对照组比较(13.91±0.90min),DRN区微注射100pmol(10.05±0.36min)和30pmol(11.6±0.36min)orexin-A后大鼠的觉醒时间均显著缩短(p<0.05)。DRN区微注射100pmol orexin-B也有促麻醉觉醒作用(10.59±0.40 min),与对照组相比觉醒时间缩短(p<0.05),但30pmol组的觉醒时间(11.78±0.56 min)与对照组相比无明显差别(p>0.05)。微注射orexinⅠ型受体拮抗剂SB334867 20ug后觉醒时间(13.81±0.18 min)比DMSO对照组(11.33±0.35 min)延长(p<0.05),但5ug组无此作用(11.84±0.46 min,p>0.05 vs对照组)。给予orexinⅡ型受体拮抗剂TCS-OX2-29后(18.07±0.67 min)也对觉醒时间无影响(p>0.05)。(2)在慢诱导,orexin-A(30pmol/0.3ul,100pmol/0.3ul)、orexin-B(30pmol/0.3ul,100pmol/0.3ul)、orexinⅠ型受体拮抗剂SB334867(5ug/0.3ul,20ug/0.3ul)和Ⅱ型受体拮抗剂TCS-OX2-29(5ug/0.3ul,20ug/0.3ul)的DRN核团微注射都对诱导时间都无影响(p>0.05)。实验二:DRN区微注射orexin及其受体配体对异氟烷麻醉诱导的脑电变化的影响方法:成年雄性SD大鼠(体重230-300g),月龄3-4m,实验前动物先在10%水合氯醛麻醉下(1ml/kg,i.p.)。(1)实验前于DRN核团区进行微注射外套管和脑电监测电极的埋置。5-7天后在氧流量为1.5L/min,异氟烷浓度为1MAC(1.4%)条件下对大鼠进行麻醉。在麻醉第30分钟时DRN区微注射orexin-A(100pmol/0.3ul)、orexin-B(100pmol/0.3ul),对照组给予saline(0.3ul)。观察从麻醉前清醒状态到异氟烷麻醉后的脑电变化以及给药的影响,计算爆发性抑制率的变化(Burst Surpression Ratio,BSR),并和对照组进行比较。(2)DRN核团微注射套管与脑电监测电极埋置术,5-7天后在氧流量为1.5L/min,异氟烷浓度为0.75MAC(1%)条件下对大鼠进行麻醉,在麻醉第30分钟,DRN核团微注射orexin-A(30pmol/0.3ul,100pmol/0.3ul),对照组给予saline(0.3ul)观察和分析脑电频谱变化。结果:(1)与对照组相比(18.72±2.69%),DRN核团微注射orexin-A后脑电的爆发性抑制率(BSR,9.55±1.54%)降低(p<0.05),脑电波向类觉醒波转变。(2)与对照组相比,DRN区微注射100pmol orexin-A后EEGδ波明显减少,而30pmol orexin-A注射组δ波仅轻微减少。实验三:orexin对麻醉过程中DRN区5-HT神经元活性的影响方法:成年雄性SD大鼠(体重230-300g),月龄3-4m,实验前动物先在10%水合氯醛麻醉下(1ml/kg,i.p.)。侧脑室微注射外套管埋置术,5-7天后在氧流量为1.5L/min,异氟烷浓度为1MAC(1.4%)情况下对大鼠进行麻醉,麻醉第15分钟侧脑室微注射orexin-A(100pmol/0.3ul)或saline(0.3ul)麻醉第30分钟处死,对照组大鼠清醒状况下心脏注射10%氯化钾处死,处死后灌注取材免疫荧光法标记5-HT神经元的活动状态,采用5-HT与c-Fos共标记确定5-HT神经元的活动状态,观察5-HT神经元活化情况。结果:用c-Fos表达细胞数量百分比表示5-HT神经元活化率,侧脑室微注射orexin-A组(12.54±1.45%)高于微注射saline组(7.20±0.78%p<0.05),与未给予麻醉处死组(13.24±1.64%)相比无统计学差异,。结论:本实验结果表明,orexin可以通过促进中缝背核的5-HT能神经元的活动,从而使麻醉中脑电波从爆发性抑制波向类觉醒波转化,EEGδ波减少,加快麻醉后动物的觉醒。