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正常骨骼处于一个吸收与重建的动态平衡状态中，其中力刺激是维持平衡的基础。不断有研究证实，牵张应力是有效促进成骨活性和功能的力学刺激。体内外力刺激通过多种途径被成骨细胞所感知，通过一系列的级联网络反应，成骨细胞将力学信号转化为生物学信号，进一步调节相关基因的表达水平，同时合成各种活性物质及酶类，最终使得机体表现出各种复杂的生理及病理活动。多种信号转导途径中，细胞骨架作为首先感受力学刺激的结构，发挥着重要作用。成骨细胞对外源性机械力信号的反应主要是由F-actin来响应的，F-actin通过与跨膜分子相互作用而成为跨膜力信号传递的主要环节。而成骨细胞细胞骨架的改建依赖于一些对力学敏感的关键蛋白的调控作用。ADF/Cofilin家族蛋白是actin结合蛋白中独一无二的解聚微丝的蛋白群，其对肌动蛋白发挥着重要调控作用：当肌动蛋白丝激活时，ADF/Cofilin家族蛋白能够切断肌动蛋白丝，增加肌动蛋白单体在肌丝末端的解聚合。这提示我们Cofilin在细胞骨架力学转导信号中发挥着重要作用。而以往的研究主要集中在内皮、神经、肌肉细胞中，对于成骨细胞的研究尚未见报道。本实验通过Flexcell应力加载系统，对人成骨样细胞（MG-63）施以不同加载时长的周期性牵张力，通过免疫荧光、RT-PCR、Western Blot、基因沉默等技术，探讨MG-63细胞受牵张力刺激后Cofilin的表达情况，以及在Cofilin正常表达与Cofilin抑制后，对上下游的成骨目的基因的影响，从而探讨Cofilin在机械力学刺激下细胞信号转导中的作用，为骨力学转导机制提供新的依据，为缩短牵张成骨时程、加速骨缺损修复开辟新的思路，并为筛选治疗骨代谢失衡相关疾病的药物提供新靶点。1.牵张应力下Cofilin在成骨细胞中表达变化的实验研究目的：应用机械牵张应力加载人成骨肉瘤细胞MG-63，通过观察和测定丝切蛋白（Cofilin）的表达和含量变化情况，初步探讨Cofilin在牵张应力引起的MG-63细胞力学信号转导过程中的作用。方法：将MG-63分为加力组与对照组，对照组不加力，采用Flexcell牵张应力加载系统，用12%大小的应力值进行力学刺激1、4、8、12、24h后，用免疫荧光染色观察Cofilin的变化，RT-PCR检测Cofilin mRNA水平的变化，Western-Blot测定细胞内Cofilin的含量。结果：MG-63细胞受应力刺激后，1、4h细胞内Cofilin染色逐渐增强，8、12、24h细胞内Cofilin染色逐渐减弱，但仍明显高于对照组。而应力作用下Cofilin mRNA水平无明显变化（p>0.05）。Western Blot显示，加载后1hCofilin含量增高(p<0.05)，4h时细胞内Cofilin含量达到高峰(p<0.05)，8、12、24h Cofilin含量逐渐减少,但仍明显高于对照组（p<0.05）。结论：机械牵张应力刺激可明显上调Cofilin表达，且具有时间依赖性，提示其可能在成骨细胞力学信号转导过程中发挥一定的作用。2.构建Cofilin蛋白低表达模型目的：为了进一步明确Cofilin的作用，本实验采取shRNA干扰载体构建Cofilin低表达模型，为下一步实验明确应力下Cofilin正常表达以及干扰后Cofilin对成骨分化及成骨相关基因mRNA表达的影响。方法：委托公司设计Cofilin基因沉默的不同shRNA片段，通过对MG-63细胞转染，荧光显微镜下观察细胞转染情况，RT-PCR检测转染后CofilinmRNA水平变化，Western blot测定细胞内Cofilin的含量。结果：4个干扰片段在mRNA水平上明显降低了Cofilin的水平（p<0.05），但各片段之间无明显差异（p>0.05）。Westernblot结果显示，1号和4号片段明显下调了Cofilin的含量（p<0.001）。结论：1号与4号shRNA干扰载体可明显抑制Cofilin的表达，且效果稳定。3. Cofilin对机械应力引起的成骨细胞成骨效应的影响目的：通过观察正常表达Cofilin的成骨样细胞与抑制表达Cofilin成骨样细胞在机械力学刺激下对成骨分化及成骨相关基因的mRNA水平的影响，从而明确Cofilin在机械力学刺激成骨中的作用，探讨Cofilin在促进机械应力介导的成骨细胞成骨效应的上下游分子机理，为成骨细胞力学信号转导机制提供新的证据。方法：细胞分为Cofilin正常表达与Cofilin抑制组，正常表达组分组方式与加力方式均同实验一，Cofilin抑制组采用实验二中筛选出的1号干扰片段，创建模式同实验二，加力组分组方法同实验一，对照组为不干扰，不加力。力学加载完成后采用Realtime-PCR方法检测成骨及成骨分化的目的基因ALP、OCN、COL1、Runx-2mRNA水平的变化。结果：Cofilin正常表达组在力学刺激后ALP、OCN、COL1、Runx-2基因的mRNA水平有明显变化，均显著高于对照组（p<0.05），Cofilin抑制后，机械力学刺激后ALP、OCN、COL1基因mRNA表达水平均明显低于对照组（p<0.05），而Runx-2基因mRNA水平与对照组相比无明显差异（p>0.05）。结论：机械力刺激下Cofilin正常表达时可明显促进MG-63细胞成骨基因活化，增强其成骨能力，而Cofilin抑制后，机械力学刺激下MG-63细胞的成骨活性明显降低，提示Cofilin作为细胞骨架调节蛋白在力学转导信号中发挥了重要作用。