背景面对难治性三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）亟需找寻新的有效途径,解决早期准确诊断、靶向增效治疗及可视化疗效评估的难题。寻找新的有效靶点,是突破三阴性乳腺癌临床诊断与治疗瓶颈的关键。最新的研究结果表明,核仁素（Nucleolin,NCL）有望成为三阴性乳腺癌早期准确诊断及有效治疗的新靶点,核酸适配体AS1411因能与核仁素特异性靶向结合并抑制肿瘤的生长而受到广泛关注。核仁素参与了细胞生命活动的多个过程,是肿瘤发生发展过程中的重要中间环节,针对核仁素的系列诊治策略,将有望实现对恶性肿瘤的精准诊断和有效治疗。相较于多肽、伪肽、重组免疫制剂等其他核仁素配体,核酸适配体最大的优势在于稳定及无免疫源性。核酸适配体AS1411是核仁素的高效配体,能特异性地识别核仁素并与之结合,阻断核仁素进一步发挥功能。核酸适配体AS1411与核仁素的相互作用,还能够刺激并激活细胞的内吞作用,促进细胞对治疗药物的摄取同时抑制药物的外渗和清除,从而实现对肿瘤部位的靶向给药及协同增效治疗。此外,基于核仁素-核酸适配体AS1411相互作用的精准分子诊断、抗肿瘤药物靶向递送系统也是重要的研究方向。虽然针对核仁素及其配体的研究已取得了一定的进展,但尚存在对核仁素更多作用机制的不明、核酸适配体体内生物利用度低、作用效果不佳等问题,还需通过进一步的深入研究及系统优化,才能真正将其应用于针对三阴性乳腺癌的临床诊断与治疗中。超声分子影像学技术可在解决三阴性乳腺癌诊治难题中发挥重要作用,其作用核心超声分子探针不仅能实现特异的超声分子显像,还能作为药物递送系统中的载体,可在增加药物稳定性的同时通过主动靶向作用将药物递送至靶标区域,还可以通过超声辐照靶向破坏微泡等技术控制药物的定点释放,从而有效降低药物对正常器官及组织的毒副反应,即在诊断的同时起到治疗的作用,实现诊疗的一体化。基于此,可将超声分子影像学技术作为解决前述问题的关键技术手段,利用核仁素这一潜在的高效靶点及其核酸适配体AS1411所具有的诊治介导优势,构建诊疗一体化超声分子探针,通过对其特异性超声分子显像特征及协同增效治疗机制的深入研究,从而实现对三阴性乳腺癌临床诊治难题的突破。本实验拟在前期研究工作的基础上,设计并构建针对三阴性乳腺癌的诊疗一体化靶向超声纳米探针,即核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡。系统研究该靶向超声纳米探针对三阴性乳腺癌的特异性超声分子显像能力,并将其作为抗肿瘤药物阿霉素的携载与递送载体,客观评估其对三阴性乳腺癌的治疗效能,从而为三阴性乳腺癌的早期准确诊断、有效治疗及可视化疗效评估提供新的方法和途径。目的1.以核仁素为靶点,构建核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡（Aptamer AS1411-functionalized nucleolin-targeted lipid nanobubbles,AS1411-NBs）,通过体内外超声造影增强显像实验研究,系统评价AS1411-NBs对肿瘤组织及肿瘤新生血管的双重靶向超声造影增强显像能力,为难治性三阴性乳腺癌的早期准确诊断及可视化疗效评估探索新的方法和途径。2.在前期研究工作的基础上,重点针对核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡在药物递送系统中的应用价值展开研究,将其作为抗肿瘤药物阿霉素的携载及递送载体,构建核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡（Nucleolin-targeted doxorubicin-loaded lipid nanobubbles,AS1411-DOX-NBs）,并对AS1411-DOX-NBs的抗肿瘤效能及心脏保护作用进行客观评价,以期为三阴性乳腺癌的临床诊治提供一种安全、高效的诊疗一体化超声纳米探针。方法1.靶向超声纳米探针构建及其对三阴性乳腺癌的增强显像实验研究（1）首先通过酰胺缩合反应,将脂质分子DSPE-PEG2000-COOH与核酸适配体AS1411进行共价连接,合成脂质-核酸靶向分子DSPE-PEG2000-AS1411。再以该靶向分子作为原材料,同时联合其他脂质分子,通过薄膜水化、机械震荡及离心漂浮等方法构建核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡。利用变性尿素聚丙酰胺凝胶电泳及激光共聚焦显微镜鉴定靶向分子及靶向脂质纳米泡是否构建成功。通过光学显微镜、透射电子显微镜及马尔文粒径仪观察、测定核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡的形貌、粒径及电位。（2）在体外,通过2%琼脂糖模型研究核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡在37℃生理条件下的超声造影增强显像情况。测定不同浓度核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡在超声造影模式下的声强变化,确定超声造影增强显像强度与脂质纳米泡浓度的关系,并对核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡与非靶向空白脂质纳米泡（Nontargeted blank lipid nanobubbles,NBs）在相同浓度下的体外超声造影增强显像强度进行比较分析。（3）首先通过细胞免疫荧光实验检测细胞株的核仁素表达情况,再进一步测定核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡与核仁素细胞膜阳性表达的人三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-468）及核仁素细胞膜阴性表达的人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）的体外靶向结合情况,以确定核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡对核仁素细胞膜阳性表达细胞的靶向结合能力。（4）建立三阴性乳腺癌裸鼠移植瘤模型,通过体内超声造影增强显像实验研究测定核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡的特异性超声造影增强显像能力,比较分析核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡与非靶向空白脂质纳米泡在体内对三阴性乳腺癌的超声造影增强显像差异,并通过组织病理学检测结果,分析核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡特异性超声造影增强显像的分子基础。2.靶向载药超声纳米探针对三阴性乳腺癌的治疗效能实验研究（1）将核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡作为抗肿瘤药物阿霉素的携载及递送的载体,构建核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡,并对核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡是否成功构建进行鉴定,并对其携载阿霉素的能力进行检测。（2）体外细胞学实验,检测核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡对核仁素细胞膜阳性表达的人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞毒性,并进一步测定核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡是否能通过主动靶向作用有效提高MDA-MB-231细胞对阿霉素的摄取而发挥更强的杀伤作用。（3）通过三阴性乳腺癌裸鼠移植瘤模型,比较分析核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡与游离阿霉素对荷瘤裸鼠生长曲线的影响及对肿瘤生长的抑制作用,以测定核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡的体内抗肿瘤效能。（4）通过超声心动图和组织病理学检测,比较分析核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡与游离阿霉素不同治疗组荷瘤裸鼠心脏功能及结构的变化,进一步评估核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡的心脏保护作用。结果1.靶向超声纳米探针构建及其对三阴性乳腺癌的增强显像实验研究（1）通过变性尿素聚丙酰胺凝胶电泳证实成功合成了脂质-核酸靶向分子DSPE-PEG2000-AS1411,且以DSPE-PEG2000-AS1411为基础膜材的核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡也得到了成功构建。光学显微镜下可见粒径均一、分布均匀、中空透亮的核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡,马尔文粒径仪与透射电子显微镜测量的粒径结果一致,核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡的平均粒径为533.5±19.91 nm,多分散指数Pd I为0.095±0.046,Zeta电位ZP为-3.41±0.17 m V,核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡与非靶向空白脂质纳米泡在粒径大小上不存在显著性差异（n=3,P>0.05）。（2）体外琼脂糖模型中,比较分析不同浓度的核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡与非靶向空白脂质纳米泡在超声造影模式下的声强变化情况,结果显示回声信号的强弱与脂质纳米泡的浓度呈显著线性相关性（n=3,0.8<r<1.0,P<0.05）,脂质纳米泡浓度越高,回声信号越强,且在相同浓度时,核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡与非靶向空白脂质纳米泡的回声信号强度不存现显著性差异（n=3,P>0.05）。（3）细胞免疫荧光实验证实,核仁素在三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞及MDA-MB-468细胞的膜和核上均有表达,而在正常HK-2细胞中仅在核内表达。竞争抑制实验显示核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡能与三阴性乳腺癌细胞发生特异性的靶向结合,且流式细胞仪靶向结合亲和力检测实验也印证了这一结果,这为核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡体内特异性超声造影增强显像研究提供了必要的实验基础。（4）裸鼠移植瘤模型体内超声造影增强显像实验结果显示,在超声造影成像初期,核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡与非靶向空白脂质纳米泡具有相同的增强显像能力,成像参数均不存在显著性差异（n=3,P>0.05）,但随着时间的积累,核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡与非靶向空白脂质纳米泡的时间-强度曲线下面积出现了显著性差异（n=3,P<0.001）,核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡的持续增强显像时间明显长于非靶向空白脂质纳米泡。组织病理学检测结果证实,核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡可通过与肿瘤细胞膜、肿瘤新生血管内皮细胞膜表面过表达的核仁素发生靶向相互作用,实现对三阴性乳腺癌肿瘤组织及肿瘤新生血管的双重靶向超声造影增强显像,从而有效延长持续增强显像的时间。2.靶向载药超声纳米探针对三阴性乳腺癌的治疗效能实验研究（1）激光共聚焦显微镜观察和紫外可见吸收光谱检测结果证实,核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡有效携载了抗肿瘤药物阿霉素,核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡构建成功,且核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡的载药量及包封率均高于非靶向载阿霉素脂质纳米泡,两者存在显著性差异（n=3,P<0.05）,分析可能的原因是核酸适配体AS1411所形成的四链体结构也能有效携载阿霉素,进而提高了靶向脂质纳米泡整体对阿霉素的携载能力。（2）体外细胞毒性实验结果显示,低剂量的核酸适配体AS1411和非靶向空白脂质纳米泡本身无明显的细胞毒性,携载阿霉素后,表现出了较强的细胞毒性,且核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡表现出了比游离阿霉素和非靶向载阿霉素脂质纳米泡更强的细胞毒性（n=3,P<0.05）。经体外细胞摄取实验结果证实,核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡可有效提高细胞对阿霉素的主动摄取。（3）裸鼠移植瘤体模型体内抑瘤实验结果显示,核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡具有与游离阿霉素相当的抗肿瘤活性。与此同时,核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡治疗组裸鼠的体重及健康状态得到了更好的维持,表明核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡治疗组所引起的毒副作用较游离阿霉素治疗组小。（4）经裸鼠超声心动图和组织病理学检测进一步证实,虽然核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡与游离阿霉素在体内的抗肿瘤活性不存在显著性差异,但核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡显著降低了阿霉素所致的心脏毒性。结论1.本研究成功设计并构建了以核仁素为靶点、核酸适配体AS1411为导向分子的超声纳米探针,即核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡（AS1411-NBs）。AS1411-NBs可通过对肿瘤细胞膜及肿瘤新生血管内皮细胞膜表面过表达核仁素的特异性识别及相互作用,实现对三阴性乳腺癌肿瘤组织及肿瘤新生血管的双重靶向超声造影增强显像,有效延长显像的时间窗,有望为三阴性乳腺癌的早期准确诊断和实时疗效评估提供新的有效方法和途径。2.核酸适配体AS1411功能化的核仁素靶向脂质纳米泡不仅具备特异性超声造影增强显像能力,还能作为抗肿瘤药物阿霉素高效携载与靶向递送的载体,所构建的核仁素靶向载阿霉素脂质纳米泡（AS1411-DOX-NBs）,能通过核酸适配体AS1411与核仁素的相互作用介导阿霉素在肿瘤部位的靶向富集,从而有效降低阿霉素所致的心脏毒性,是一种能用于三阴性乳腺癌早期准确诊断及有效治疗的安全、高效的诊疗一体化超声纳米探针。