研究背景及目的:宫颈癌作为世界上最常见的妇科恶性肿瘤,在女性患者中罹患恶性肿瘤疾病发病率上仅次于乳腺癌和结直肠癌而居于第3位[1]。目前在宫颈癌治疗方式的选择上,对于早期发现的患者可以通过手术病灶切除以根治或延缓疾病发生发展,对于晚期宫颈癌的常规治疗是同期放化疗。[2]然而,放化疗对大部分中晚期患者的疗效有限,中晚期宫颈癌患者的复发及转移问题仍未解决,故需要新的方法攻克这一难题。信号转导和转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription,STAT3)是存在于生物体内的主要起调控转录作用的基因,参与细胞的生长、分化、增殖与凋亡等一系列病理生理过程[3]。也被发现在多种肿瘤组织及细胞中高表达,与肿瘤的发生、发展、复发、转移及患者预后等明显相关,并起着重要的相关调控作用[4]。同时存在大量的证据表明,相关癌基因或抑癌基因的调控失常导致肿瘤细胞的凋亡及自噬异常,从而使宫颈癌细胞的增殖、分化及转移机制失控,导致肿瘤恶化发展[5]。因此,我们拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术探讨STAT3基因在宫颈癌细胞凋亡、自噬发生发展中扮演的角色以及可能的分子机制,以期控制宫颈癌的转移及复发,为提高中晚期宫颈癌或复发转移性宫颈癌患者的生存率提供新思路。方法:1.通过选用肿瘤oncomine公共数据库芯片进行生物信息学分析或免疫组织化学检测STAT3基因、凋亡相关基因Bcl-2及自噬相关基因Beclin1蛋白在宫颈癌组织石蜡标本中的表达情况;2.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建STAT3突变的单克隆宫颈癌Siha细胞稳转株并采用CCK8法、细胞克隆形成实验、transwell实验及裸鼠皮下种植瘤实验观察敲除STAT3对宫颈癌Siha细胞的生物学特性的影响。3.分别用Western-blot实验、qPCR法检测在STAT3各表达组宫颈癌细胞及皮下成瘤后肿瘤组织中自噬相关基因Beclin1、凋亡相关基因Bcl-2、P62、LC3-Ⅱ蛋白及mRNA 水平的变化。4.电镜检测不同STAT3表达组细胞中凋亡小体及自噬小体数量的差异;联合氯喹处理检测不同表达组细胞中自噬流变化;运用免疫共聚焦检测STAT3与Bc12的相互作用。运用共聚焦显微镜观察经DAP/DALGreen染色检测不同处理组自噬小体及自噬溶酶体差异。结果:1.检索肿瘤公共数据库Oncomine,分析结果提示STAT3基因、凋亡相关基因Bcl-2及自噬相关基因Beclin1在宫颈癌组织中的表达水平,与癌旁正常组织对比,均显著增高。2.成功通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建STAT3突变的单克隆Siha宫颈癌细胞稳转株:低表达组(KO组)、低表达对照组(Vetor);与对照组对比,敲除STAT3基因后宫颈癌Siha细胞的体外增殖、迁移、克隆形成能力及肿瘤体内成瘤性均显著抑制。3.Western blot实验、qPCR法检测在STAT3各表达组宫颈癌细胞稳转株中自噬相关基因Beclin1、凋亡相关基因Bcl-2、P62、LC3-Ⅱ蛋白及mRNA水平的变化,结果提示与对照组相比,STAT3低表达组宫颈癌细胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ和P62的蛋白及mRNA表达量增加,而Bcl-2的蛋白及mRNA表达水平下降。4.与对照组对比,电镜观察敲除STAT3组细胞中凋亡小体及自噬小体的数目增多,自噬流检测水平增高。荧光共定位实验显示,STAT3与Bc12存在空间共定位。运用共聚焦显微镜发现在宫颈癌STAT3敲除组细胞株中自噬溶酶体及自噬小体较对照组增加。结论:STAT3在宫颈癌组织中高表达,在靶向抑制STAT3的表达后,其下游信号通路被抑制,抗凋亡分子Bc12的表达水平明显下降,促进凋亡的发生,“保护性自噬”功能被激活,表现为宫颈癌肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及成瘤能力等生物学特性被抑制,同时利用敲除STAT3稳转株细胞构建动物模型验证对体内凋亡及自噬活动的影响,同样表现为促进凋亡及自噬的发生。另外我们通过共定位实验显示STAT3与Bcl2存在共作用,提示STAT3介导的宫颈癌发生发展可能通过STAT3-Bcl2通路影响Beclin-1 水平调节自噬而发挥作用,因此,靶向STAT3基因的分子治疗可能改善目前针对宫颈癌的临床治疗结局。