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香石竹(Dianthuscaryophyllus)又名康乃馨,是全球销量最大的花卉之一,花朵还可提炼香精。在育种工作中,无人工处理条件下的香石竹通常不结实,成为其在杂交育种上的局限。原生质体融合育种能够克服香石竹杂交育种的局限,为香石竹耐高温、高观赏性状育种提供有利途径。高效的香石竹原生质分离、纯化及再生体系的建立,将为此育种工作提供基础。本实验以香石竹无菌系叶片为主要材料,分析了其原生质体分离、纯化及再生体系建立等相关条件。确立了香石竹原生质体培养的最佳的酶解方式、酶液组分、浓度水平、酶解时间和纯化方式。并对原生质体培养方式、激素种类与浓度水平、植株再生体系进行探究。结果如下:1.香石竹原生质体分离:1)渗透压稳定剂:利用质壁分离测定香石竹无菌系叶片的渗透压为0.5mol/L,选用甘露醇溶液作为渗透压稳定剂;2)原生质体粒径大小:通过显微镜标尺测量,香石竹原生质体粒径大小在40-70μm之间,选用200目尼龙网进行初步纯化;3)采用静置酶解—界面纯化法与低速振荡—沉降纯化法进行原生质体分离与纯化:静置酶解—界面纯化法,最适条件为0.3%纤维素酶+0.5%离析酶,酶解时间为12h。最高产量达4.33×105Cell/gFW,活力83.87%;低速振荡—沉降纯化法,最适条件为1.5%纤维素酶+0.2%果胶酶,酶解时间为3.5h,最高产量为1.83×107Cell/gFW,活力96.3%,此法极大地缩短了酶液作用时间,在操作以及原生质体产量、活力等方面均优于静置—界面纯化法。2.’马斯特’原生质体的培养:1)以MPSCul、KM8P为基础培养基,对激素种类、浓度、培养方法等进行试验,实现了香石竹’马斯特’原生质体的连续分裂。因原生质体的培养过程复杂,对不同阶段的培养产物及培养方式进行划分:细胞团形成期,液体浅层培养,LMP培养基(Liquid medium of protoplast):KM8P+5mg/LNAA 和 1mg/LZT。小愈伤形成期,固—液双层培养,培养基SLMP(Solid liquid double layer medium of protoplast):固体层 MS 基本培养基+0.5M 葡萄糖+5.0mg/LNAA+1.0mg/LZT,液体层KM8P液体+0.5M葡萄糖+5.Omg/LNAA+1.Omg/L ZT。愈伤组织增殖期,固体培养基 DMP4-1:MS+8%蔗糖+1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L ZT,DMP4-2:MS+6%蔗糖+1.0mg/L2,4-D+0.5mg/LZT,不同培养时期,依其特性的不同,培养方式存在差异。2)原生质体再生体系的建立:原生质体增殖形成的愈伤组织,转入植株再生培养基中后,逐渐增殖变绿,其中添加TDZ的植株再生培养基中,愈伤组织状态最佳,因植株再生所需周期较长,植株再生研究仍在进行中。