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第一部分BRD4在IL-1β诱导的体外大鼠髁突软骨细胞炎症反应中的作用机制研究[目的]检测抑制BRD4的表达能否抑制IL-1β刺激下大鼠髁突软骨细胞中的炎症因子的表达,并探究其作用机制。[方法]选择3周龄雄性SD大鼠6只,提取大鼠髁突软骨原代细胞,将第三代大鼠髁突软骨细胞用于实验。第一部分为BRD4抑制剂JQ1的实验,实验设置空白对照组、IL-1β组、JQ1组以及IL-1β+JQ1组,选取浓度为10ng/ml的IL-1β和400nM的JQ1分别作用24h;第二部分为小干扰RNA siBRD4的实验,实验设置空白对照组、IL-1β 组、IL-1β+siNC 组以及 IL-1β+siBRD4 组,siBRD4 以及 siNC在转染48h后进行IL-1β刺激处理24h,观察Brd4基因沉默后炎症基因的表达是否下降。实时荧光定量聚合酶链式反应检测Brd4以及Il-1β、Il-6、Nrf2、Nlrp3 mRNA的表达改变;Western-blot检测BRD4、NRF2以及NLRP3蛋白的表达改变。[结果]1.BRD4抑制剂JQ1可以抑制IL-1β刺激大鼠髁突软骨细胞产生炎症反应。IL-1β+JQ1组的Brd4、Il-1β、Il-6以及Nlrp3 mRNA表达量分别下降至IL-1β组的 29.6%、25.3%、11.8%以及 13.0%,IL-1β+JQ1 组的Nrf2 mRNA 表达量升高至IL-1β组的1.6倍。与IL-1β组相比,加入JQ1后,BRD4和NLRP3的蛋白表达量分别下降至IL-1β组的7.3%和80.2%,NRF2蛋白表达量升高至IL-1β组的1.4倍。单纯JQ1组中Brd4、Il-1β、Il-6和Nlrp3 mRNA表达量分别为Blank组的42.4%、57.8%、18.1%以及14.3%,单纯JQ1组中BRD4和NLRP3的蛋白表达量为 Blank 组的 19.6%和 75.7%。2.小干扰RNA siBRD4可以抑制IL-1β刺激的大鼠髁突软骨细胞的炎症反应。IL-1β+siBRD4组的Brd4、Il-1β、Il-6、Nlrp3 mRNA 表达量降低至 IL-1β+siNC 组的 30.0%、9.7%、6.0%以及64.1%,IL-1 β+siBRD4 组的 Nrf2 mRNA表达升高至IL-1β+siNC组中的2.8倍。与IL-1β+siNC组相比,加入siBRD4后,BRD4和NLRP3的蛋白表达量分别下降至IL-1 β+siNC组的30.6%和75.1%,NRF2蛋白表达量升高至IL-1 β+siNC组的1.3倍。[结论]在炎症反应发生时,Brd4、Nlrp3参与正向炎症反应调节。Brd4被抑制后,Nrf2表达上调,从而抑制Nlrp3表达,炎症反应得到缓解。第二部分与超负荷压应力作用下大鼠髁突软骨炎症反应相关的BRD4靶基因鉴定[目的]通过ChIP-seq实验筛选与BRD4结合的大鼠髁突软骨炎症相关基因,阐明BRD4参与超负荷压应力介导的大鼠髁突软骨OA样病变过程的分子机制。[方法]选择8周龄雄性SD大鼠,建立大鼠颞下颌关节压应力加载动物模型。按本课题组自主设计的大鼠颞下颌关节压应力加载动物模型装置（专利号:201120210396.4）,对加力组大鼠髁突软骨施加向上、向后的压应力（80g）,加力时间设7天,非加力组大鼠进行同样的操作,但不实施实质性的压应力加载。加力后,取正常组和加力组大鼠髁突软骨进行实时荧光定量聚合酶链式反应检测（RT q-PCR）和染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）实验。对ChIP-seq结果中结合位点位于启动子区域的基因进行Venny图分析,筛选加力后与BRD4结合增多的基因;使用UCSC制作可视化图,进一步筛选与炎症相关的基因,进行q-PCR验证。[结果]1.qPCR结果显示:加力组与对照组相比较,大鼠髁突软骨中IL-1β以及Brd4 mRNA表达量升高。相对于对照组,加力组中Brd4、Il-1β mRNA表达量分别为对照组的1.8倍和4.2倍。2.ChIP-seq结果显示:加力组与对照组相比较,Brd4与Il-1β、Il-6st、Hmg20a、Vopp1、Cpxm1、Ypel3、Arfip1、Fktn、ler5、P2ry1、Taar3、Klkb1、Clic2、Lipn、Agtrap、Ppm1k、Ints2、Polg、Mall 启动子区域结合增多。其中,Il-1β、Il-6st、Ebf2、Vopp1为促炎基因,Cpxm1为抑炎基因。加力组与对照组相比较,Il-6st、Ebf2以及Vopp1的mRNA表达量分别为对照组的2.0、3.9以及5.0倍,Cpxm1 mRNA表达量降低,加力组仅为对照组的24.9%。[结论]超负荷压应力加载在大鼠颞下颌关节后,BRD4和Il-1β、Il-6st、Ebf2、Vopp1、Cpxm1启动子区域的结合增多,促进了炎症反应的发生。第三部分与大鼠髁突软骨生长发育相关BRD4靶基因鉴定[目的]通过表观遗传蛋白BRD4的ChIP-seq实验,筛选与BRD4结合的大鼠髁突软骨生长发育相关基因,阐明BRD4参与大鼠髁突软骨生长发育过程的分子机制。[方法]1.选择3周龄和8周龄雄性SD大鼠髁突软骨组织进行Brd4 mRNA表达量的检测。2.选择8周龄雄性SD大鼠,取正常的大鼠髁突软骨进行染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）实验。对测序结果进行GO分析,筛选与髁突软骨生长发育相关的Brd4结合基因,使用UCSC制作可视化图。3.通过q-PCR进行3周龄与8周龄SD大鼠筛选出的与髁突软骨生长发育相关的基因的验证。[结果]1.q-PCR结果显示:8周龄大鼠髁突软骨中Brd4 mRNA的表达量是3周龄的2.0倍。2.GO分析显示:在大鼠髁突软骨中,BRD4可以结合在Cited1,Foxc1 Grem1、Egfl7、Dll4、Mmp14、Mmp19、Smad6、Col13a1、Wnt8a 等基因的启动子区域,其中,Foxc1、Cited1 为促软骨生成基因,Mmp14、Mmp19、Col13a1、Grem1、Egfl7为与软骨基质改建相关的基因,Wnt8a、Dll4、Smad6为信号通路相关基因。3.8 周龄组大鼠髁突软骨中 Foxc1、Cited1、Wnt8a、Col13a1、Mmp19、Dll4、Smad6 mRNA 表达水平分别是 3 周龄组的 3.1、1.8、2.5、2.1、3.3、3.0、4.4 倍,Grem1和Egfl7在8周龄SD大鼠髁突软骨中mRNA表达量较3周龄的降低,分别为3周龄的30.6%以及43.2%,Mmp14在3周龄和8周龄SD大鼠髁突软骨中的mRNA表达量无明显差异。[结论]BRD4 可能通过与 Cited1、Foxc1、Grem1、Egfl7、Dll4、Mmp14、Mmp19、Smad6、Col13a1、Wnt8a等靶基因的作用,参与了大鼠髁突软骨的生长和发育。