论文部分内容阅读
背景：尼克酰胺N-甲基化酶(nicotinamide N-methylransferase,NNMT,EC2.1.1.1)是S-腺苷-L蛋氨酸依赖的甲基转移酶,以S-腺苷-L蛋氨酸为甲基供体,催化尼克酰胺及其他吡啶类化合物的甲基化,参与尼克酰胺平衡、药物及其他外源性物质的代谢。正常主要表达于人肝脏组织中,其次在肾、肺、骨骼肌、心脏、胎盘等组织中也有一定表达。目前发现NNMT在恶性胶质瘤、胰腺癌、肾癌、甲状腺乳头状癌、胃癌、结直肠癌等多种肿瘤组织中存在异常高表达,且与肿瘤细胞增殖、转移、耐放化疗等多种生物学功能密切相关。但NNMT在肿瘤细胞中过表达对肿瘤细胞耐药及其相关机制方面有待进一步研究。目的：研究NNMT过表达对人结直肠癌细胞SW480对5-FU耐药方面的影响及相关机制,为肿瘤个体化治疗和基因治疗寻找新的潜在靶点。方法：采用已构建好的真核表达质粒pcDNA3.1/NNMT,及相应的pcDNA3.1空质粒转染人结直肠癌细胞系SW480,用G418筛选稳定转染的细胞株,建立NNMT稳定高表达的肿瘤细胞模型和空质粒pcDNA3.1转染的空白对照模型。采用Real-Time QPCR和Western blot分别验证转染前后NNMT mRNA和蛋白水平的表达,MTT法分析NNMT对肿瘤细胞5-FU敏感性的影响、流式细胞术分析细胞凋亡变化、Western blot检测相关信号通路及凋亡分子的变化。结果：成功构建并分离SW480细胞系NNMT过表达模型单克隆两株(SW480/NNMT-29、SW480/NNMT-40)及相应单克隆空白对照模型(SW480/Vector)。NNMT过表达表达显著降低了结直肠癌细胞系SW480细胞对5-FU的敏感度,明显减少了5-FU诱导的凋亡,且内源性和外源性凋亡通路均参与了NNMT介导的肿瘤细胞对5-FU的耐药。另外,ERK、P38、JNK/MAPK信号通路均参与了NNMT介导的肿瘤细胞对5-FU的耐药。结论：NNMT介导肿瘤细胞对5-FU的耐药并与抗凋亡机制和MAPK信号通路密切相关,这为NNMT作为结直肠癌对5-FU化疗效果的预测分子及基因治疗的靶点提供了理论依据。