多囊卵巢综合征（Polycystic ovarian syndrome,PCOS）是发生在育龄女性中常见的生殖障碍疾病,发病率约为5%-10%,是无排卵性不孕的常见病因。而在畜牧业生产实践中,卵泡囊肿也是母猪中常见的繁殖障碍疾病,可导致母猪不能排卵,大大降低母猪的繁殖性能,给养殖业造成巨大的经济损失。研究表明,雌性动物生育能力下降的主要原因是卵母细胞质量下降,临床上PCOS患者经过辅助生殖技术治疗后,虽然得到更多数量的卵母细胞,但排出的卵母细胞质量依然较差,会导致受精率低下、受精卵分裂率和胚胎附植率低下以及流产率高等问题,所以卵母细胞质量低下是关键问题。线粒体是卵母细胞胞质中含量最为丰富的细胞器,在卵母细胞成熟及胚胎发育过程中有着极其重要的作用。有文献报道,PCOS患者血液中同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）浓度显著上升,同时也发现PCOS患者卵泡液中Hcy浓度异常升高。但是,Hcy与猪卵泡囊肿卵巢中卵母细胞质量普遍下降之间的具体联系还未见报道。本研究利用猪卵泡囊肿卵巢作为材料,研究Hcy与线粒体功能及卵母细胞质量之间的关系及其机制,为临床治疗提供新思路。1同型半胱氨酸与猪卵泡囊肿卵巢中卵母细胞质量之间的关系从南京栖霞区屠宰场采集三元青年母猪（杜约克×长白×大白,135-170日龄,70-120kg）的卵巢,收集处于卵泡期的卵巢,根据卵泡囊肿的标准,分为正常组（Control）和卵泡囊肿组（Polycystic ovaries,PCO）,收集正常卵巢以及卵泡囊肿卵巢中直径3-6 mm卵泡中卵泡液,分离卵丘卵母细胞复合体（Cumulus-Oocyte Complexes,COCs）。COCs继续进行体外成熟培养,检测卵母细胞发育能力,或者用0.1%透明质酸酶去除COCs中卵丘细胞,收集卵母细胞提取DNA、RNA、蛋白或者染色。试验发现,PCO组卵母细胞成活率显著降低;而即使存活的卵母细胞第一极体排出率也是极显著下降。孤雌激活后2-细胞分裂率在两组间无显著差异,但4-细胞分裂率以及囊胚率在PCO组显著下降,囊胚中细胞数目在PCO组也是显著下降的。与Control组相比,PCO组线粒体在卵母细胞胞质中的分布模式显著变化,同时线粒体膜电位极显著下降。采用透射电镜观察线粒体超微结构,Control组线粒体超微结构显示清晰完整的内膜、外膜以及内嵴;而PCO组线粒体则显示出明显的球形,并且无内嵴。与Control组相比,PCO组线粒体DNA拷贝数显著降低。PCO组中13个线粒体编码基因之中有7个基因的表达水平是下调的,其中ND1、ND4L、ND5、COX1和CYTB是显著下降的,ND2和COX2有下调的趋势,同时12S rRNA和16S rRNA的表达水平也是显著下调的。DNA甲基化转移酶1（DNAmethyltransferase1,DNMT1）的mRNA及蛋白表达水平在PCO组是显著升高的。PCO组卵泡液中Hcy浓度极显著高于Control组;而参与一碳代谢的甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶（Betaine-homocysteine S-methyltransferase,BHMT）和 甘氨酸-N-甲基 转移酶（Glycine N-methyltransferase,GNMT）的mRNA及蛋白水平在PCO组也是显著上调的。采用亚硫酸盐测序法检测卵母细胞线粒体编码基因12S rRNA、16SrRNA、COX1、COX2、COX3和ND4的DNA甲基化水平,发现PCO组12S rRNA、16SrRNA和ND4的DNA甲基化水平显著上调,PCO组D-loop区甲基化水平显著高于Control组。以上结果表明,猪卵泡囊肿卵巢中卵母细胞质量下降伴随着Hcy浓度升高、一碳代谢异常激活、线粒体编码基因甲基化升高及线粒体功能障碍。2同型半胱氨酸影响猪卵母细胞中一碳代谢及线粒体功能收集正常卵巢直径3-6 mm卵泡中卵泡液,分离COCs进行体外成熟培养,试验处理分别为:Control组,正常体外成熟培养基中培养;Hcy组,培养基中添加Hcy,浓度为100μM或者200 μM。体外成熟培养结束后,检测卵母细胞发育能力,或者用0.1%透明质酸酶去除COCs中卵丘细胞,收集卵母细胞提取DNA、RNA、蛋白或者染色。试验发现,Hcy 100 μM和200 μM处理显著降低卵母细胞存活率以及存活的卵母细胞第一极体排出率。Hcy 100 μM处理对4-细胞分裂率没有显著影响,但Hcy 200μM处理显著降低4-细胞分裂率,囊胚率在两种浓度Hcy处理后都显著下降。综合以上数据,Hcy 100μM和200 μM都可降低卵母细胞质量和胚胎发育潜能,但相对Hcy 100μM处理,Hcy 200 μM处理对胚胎分裂率影响较为显著,所以在接下来的试验中采用Hcy 200 μM作为处理浓度。线粒体活性氧（Reactive oxygen species,ROS）在Hcy处理后显著上调;Hcy处理显著降低了线粒体DNA拷贝数;与Control组相比,Hcy,处理后显著降低了 13个线粒体编码基因之中7个基因的表达水平,包括COX2、ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L 和 ND5,同时12S rRNA 和 16S rRNA 的表达水平也是显著下降的。Hcy处理显著升高了 DNMT1、BHMT和GNMT的mRNA表达水平,而Hcy处理也显著升高了 BHMT和GNMT的蛋白水平,DNMT1蛋白水平也有所上升,但没有达到显著水平。以上结果说明,Hcy处理卵母细胞,可激活一碳代谢并导致线粒体功能障碍以及卵母细胞质量下降。3 DNA甲基化转移酶抑制剂5’AZA缓解猪卵母细胞中一碳代谢激活及线粒体功能障碍收集正常卵巢中直径3-6 mm卵泡中卵泡液,分离COCs进行体外成熟培养,试验处理分别为:Control组,正常体外成熟培养基中培养;Hcy组,培养基中添加Hcy,浓度为200μM;Hcy+5,AZA组,培养基中同时添加200 μMHcy和10nM5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-AZA-2’-deoxycytidine,5’AZA）;5’AZA 组,培养基中添加 10nM5’AZA。体外成熟培养结束后,检测卵母细胞发育能力,或者用0.1%透明质酸酶去除COCs中卵丘细胞,收集卵母细胞提取DNA、RNA、蛋白或者染色。在Hcy处理正常卵母细胞情况下添加5’AZA,与Hcy组相比,发现添加5’AZA后显著下调了BHMT和GNMT的mRNA表达水平,同时下调了DNMT1的mRNA表达水平,但是未达到显著水平;添加5’AZA也显著缓解了 BHMT的蛋白水平,对GNMT的蛋白水平有缓解趋势。采用亚硫酸盐测序法检测卵母细胞线粒体编码基因12S rRNA和16S rRNA的DNA甲基化水平,发现Hcy和5’AZA处理对12S rRNA的DNA甲基化水平无显著影响。但Hcy处理后16S rRNA的DNA甲基化水平显著上升,添加5’AZA后其甲基化水平显著下降。添加5’AZA显著缓解Hcy处理引起的线粒体ROS上调。添加5’AZA能显著缓解Hcy处理引起的线粒体DNA拷贝数显著降低,Hcy处理后显著降低了 13个线粒体编码基因之中的7个基因以及12S rRNA和16S rRNA的表达水平,而添加5’AZA能显著缓解以上基因的下调。5’AZA显著缓解Hcy处理引起的卵母细胞成活率和第一极体排出率下降。单独添加5’AZA对卵母细胞成活率和第一极体排出率无显著影响。5’AZA显著缓解Hcy处理引起的孤雌激活后4-细胞分裂率和囊胚率下降,单独添加5’AZA对胚胎分裂率无显著影响。以上结果说明,添加5’AZA部分缓解了 一碳代谢的激活及线粒体编码基因DNA的甲基化水平上升,同时缓解Hcy处理引起的卵母细胞质量下降及其线粒体功能障碍。4同型半胱氨酸影响猪卵母细胞中RNA甲基化m6A修饰收集正常卵巢中直径3-6 mm卵泡的卵泡液,分离COCs进行体外成熟培养,试验处理分别为:Control组,正常体外成熟培养基培养;Hcy组,培养基中添加Hcy,浓度为200μM。体外成熟培养结束后,检测卵母细胞发育能力,或者用0.1%透明质酸酶去除COCs中卵丘细胞,收集卵母细胞提取RNA、蛋白或者染色。采用夹缝印记检测猪卵母细胞及不同组织间总6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）的修饰水平,发现猪卵母细胞中有m6A修饰。而Hcy处理卵母细胞后m6A修饰水平上升。Hcy处理显著上调了 m6A甲基化修饰酶METTL3和去甲基化修饰酶FTO的蛋白表达水平,同时降低了 m6A阅读蛋白YTHDF2的蛋白表达水平。采用免疫荧光法发现m6A可定位线粒体,Hcy处理后m6A荧光值极显著上升。通过对小鼠胚胎成纤维细胞的m6A-seq数据进行分析,发现线粒体编码基因中COX3、ND2、ND3、ND4L和ND5的mRNA上,有明显m6A峰,表明线粒体编码基因的转录本中有m6A修饰;但在氨基酸缺乏处理下,m6A修饰水平无显著变化。而热应激处理MEF细胞后,COX2、ND5、ND6、CYTB和ATP8的m6A修饰发生显著变化,包括原m6A修饰位点m6A修饰水平降低以及其他位点m6A修饰水平上升等。同时对12S rRNA以及16S rRNA转录本上的m6A修饰进行了分析,发现两者都有显著的m6A修饰,尤其是16S rRNA,但对氨基酸缺乏以及热应激处理无显著变化。以上结果提示,小鼠线粒体编码基因的转录本上有m6A修饰,对不同应激反应有不同变化。以上结果说明,猪卵母细胞中也有m6A修饰,Hcy处理卵母细胞可以改变m6A相关酶的表达水平,Hcy处理可升高m6A总体修饰水平以及在线粒体内的修饰水平,而小鼠线粒体转录本上的m6A修饰对不同应激反应有不同变化,是潜在的生物学靶点。综上所述,本研究首先发现了猪卵泡囊肿卵巢中卵母细胞质量下降伴随着Hcy浓度升高、一碳代谢激活以及线粒体编码基因DNA甲基化水平升高,随后用Hcy处理正常卵母细胞,发现Hcy可以导致卵母细胞质量下降及其线粒体功能障碍,同时激活了一碳代谢,并改变了线粒体编码基因DNA甲基化以及RNA甲基化m6A修饰途径,而添加DNA甲基化转移酶抑制剂5’AZA可以缓解Hcy处理引起的卵母细胞质量下降及其线粒体功能障碍。