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微小RNA(microRNAs, miRNAs)是18-24个核苷酸的非编码单链小分子RNA,它可以通过与靶mRNA3’UTR区互补结合,抑制靶基因表达或促使靶基因降解,在基因转录后水平上,对基因的表达起负调节作用或基因沉默,具有调节发育时相的作用,并参与多种疾病过程。miR-146a是在固有免疫中具有重要作用的miRNA。抗细菌感染反应通过NF-κB使miR-146a表达增加,miR-146a又可抑制下游固有免疫受体TRAF6和IRAK1的表达,对炎症反应起重要的负反馈抑制作用。MiR-146a在免疫系统中也可作为肿瘤抑制因子发挥作用：敲除miR-145及miR-146a可以导致骨髓增生异常综合症(myelodysplastic syndrome, MDS);缺失miR-145及miR-146a,会在小鼠模型中导致白血病的产生；重新表达miR-145或miR-146a则阻止了白血病细胞的生存及生长。慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是造血干细胞水平发生的获得性恶性血液肿瘤。染色体异位t(9;22)(q34;qll)形成BCR/ABL融合基因,其编码的特异性融合蛋白BCR/ABL具有强烈酪氨酸激酶活性,异常调控多种生物学行为,引发宿主细胞恶性转化。BCR/ABL调节的主要信号通路有NF-κB、 STATs、PI3K、RAS-MAPK途径等。NF-κB二聚体对靶启动子的结合启动了多种免疫调节基因的转录激活。通过抑制BCR/ABL融合酪氨酸蛋白激酶活性,进而逆转其下游信号通路来治疗CML已有近十年的历史,其中最有代表性的BCR/ABL抑制剂就是格列卫(Gleeve, imatinib mesylate, STI571)。用格列卫抑制CML细胞的BCR/ABL活性会抑制NF-κB的转录活性,受NF-κB调控的基因表达也将受到抑制,其中包括：miRNAs。但影响细胞内miRNAs水平的因素很多,归纳起来有如下几种：第一,某条/某些染色体发生缺失等异常改变,会导致定位于该条/该群染色体上的pre-miRNA基因缺失或拷贝数异常,进而导致成熟miRNAs水平的改变。第二pre-miRNA基因启动子上游区域发生甲基化等表观遗传学改变,抑制转录。第三,与pre-miRNA基因启动子结合的一种或数种转录因子的在胞核中的浓度水平,或与启动子区结合的能力发生了改变,导致转录过程异常激活或抑制。第四,大部分miRNAs由RNA聚合酶II转录成长RNAs,再由Drosha酶转变成70nt的pre-miRNAs。pre-miRNAs由Exportin5转移至细胞浆,并由Dicer酶转变成22nt的成熟双链miRNAs,其中一条链被装配到RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)中发挥作用。miRNAs加工成熟过程中相关的酶和蛋白等水平异常改变,会导致某些成熟miRNAs的水平降低。第五,细胞通过胞吐/胞吞作用,主动以囊泡的方式排出或从外环境中摄取miRNAs,导致细胞内特定miRNAs的浓度水平发生改变。本研究的目的是观察BCR/ABL抑制剂格列卫作用后CML患者及细胞系K562细胞中miR-146a及miR-29的表达水平变化,探讨甲基化酶水平的改变。观察miR-146a表达水平对K562细胞的作用,并探讨K562细胞中miR-146a维持在较低水平的可能机制。我们通过台盼蓝染色及MTT的方法,观察了格列卫对K562细胞的增殖抑制作用,并用SPSS13.0软件,计算出格列卫作用于K562细胞时的IC50浓度为40.85μmol。通过茎环引物法及荧光定量PCR的方法检测不同浓度(30μmol、50μmol)格列卫作用于K562细胞后,两种miRNAs的表达水平,观察到作为NF-κB的下游靶基因之一,miR-146a的表达在格列卫作用后并未受到抑制,反而表达水平升高,计算用药组相对于生理盐水对照组miR-146a表达水平的倍数(设定对照组表达水平为1),结果以log (2-ddCt)表示,计算均值及SE,低浓度组miR-146a表达水平为1.423±0.093(97.5%CI(0.844,2.003)),高浓度组miR-146a表达水平为1.700±0.567(97.5%CI(-1.820,5.210))。另有研究证实,CML患者用格列卫治疗后外周血单个核细胞中miR-146a的表达水平也会上升。而我们也检测了2例CML加速期患者口服格列卫两周后,外周血单个核细胞中miR-146a的水平。由于miR-146a表达水平上升对K562细胞凋亡的作用尚不明确,因此我们通过转染miR-146a mimics的方法观察了其对K562细胞增殖的影响。通过LONZA核转染的方法在K562细胞中转染miR-146a mimics,于转染后24h进行Annexin-V染色,并用流式细胞仪检测K562细胞凋亡情况,结果表明过表达miR-146a可以使K562细胞凋亡增加。CML K562细胞通过使细胞内miR-146a处于较低水平,一定程度上维持了其恶性增殖的行为。而K562细胞中miR-146a低表达的机制尚待研究。我们分析了CML K562细胞在不同浓度30μmol、50μmol)格列卫作用后miR-29b以及DNMT1、DNMT3a、DNMT3b三种甲基化酶的水平,miR-29b在格列卫作用后表现出了上升的趋势,计算用药组相对于生理盐水对照组miR-146a表达水平的倍数(设定对照组表达水平为1),结果以log(2-ddCt)表示,计算均值及SE,低浓度组miR-29b表达水为0.397±0.246(97.5%CI(-1.132,1.925)),高浓度组miR-29b表达水平为0.903±0.445(97.5%CI(-1.856,3.663)),而三种甲基化酶表达水平均有所降低,低浓度组,DNMT1表达水平为-4.245±1.637(97.5%CI(-14.402,5.912)),DNMT3a表达水平为-2.197±1.084(97.5%CI(-8.920,4.527)),DNMT3b表达水平为-1.810±1.403(97.5%CI(-10.516,6.896)),高浓度组DNMT1表达水平为-2.715±0.539(97.5%CI(-6.065,6.348)),DNMT3a表达水平为-1.587±0.681(97.5%CI(-5.812,2.639)),DNMT3b表达水平为-2.015±1.989(97.5%CI(-14.357,10.327)),与对照组相比,差异无统计学意义。为进一步分析miR-146a的转录调控机制,我们通过MatInspector软件对miR-146a启动子区进行了分析,发现存在数个NF-κB和C/EBPβ结合位点。进一步在K562细胞中采用凝胶电泳迁移率检测(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)验证C/EBP β与miR-146a启动子区的结合能力,结果表明,C/EBPβ与pre-miR-146a启动子区并无特异性结合,但并未排除C/EBPβ与NF-κB相互作用调控miR-146a转录的可能。