大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)是一类在自然界中存在范围广,血清型复杂,致病性多样的重要的人畜共患病原菌。根据遗传和致病特点,可将大肠杆菌分为以下3种类群：共生菌群,致腹泻型菌群和肠外致病性菌群。肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli, ExPEC)是指一群能在肠道中定殖不引起腹泻但能引起肠外组织感染的一类大肠杆菌。ExPEC因其特异性的毒力因子而引起人和动物特定的疾病,包括：人新生儿脑膜炎,泌尿道感染,猪的肺炎、肾炎、脑膜炎、败血症等,禽的气囊炎、滑膜炎、腹膜炎、败血症等。铁是大肠杆菌生存必需的一种重要的营养元素,许多代谢活动都需要铁的参与。血红素(heme)是大肠杆菌主要的铁源之一,heme的摄取能力直接关系到大肠杆菌在宿主体内生存代谢的能力。由heme载体介导的heme摄取途径是heme的一种重要吸收方式,hmuU基因和hmuV基因是参与该途径的重要基因,而通过比较本实验室已经测序的5株猪源肠外致病性大肠杆菌强弱毒株间heme摄取系统的差异基因发现hmuU基因和hmuV基因在强弱毒株间存在差异,推测hmuU基因和hmuV基因可能在大肠杆菌的毒力和致病性方面有功能。因此本研究以大肠杆菌强毒株PCN033为亲本菌,构建了3株肠外致病性大肠杆菌PCN033株的基因缺失突变株△hmuU,△hmuV与△hmuU/△hmuV,并对其生物学特性及小鼠毒力进行了研究。主要研究内容如下：1.肠外致病性大肠杆菌PCN033株基因缺失突变株△hmuU,△hmuV与△hmuU/△hmuV的构建与鉴定以PCN033株基因组为模板,扩增hmuU基因和hmuV基因的上下游同源臂,扩增产物分别连接到自杀性质粒pRE112上构建重组质粒pRE△hmuU、pREAhmuV和pRE△hmu。分别将重组自杀性质粒pRE△hmuU和pRE△hmuV转化大肠杆菌X7213,与PCN033株进行接合转移,经过两次单交换筛选出单基因缺失突变株AhmuU(?)(?)△hmuV。双基因缺失突变株是在单基因缺失突变株△hmuV的基础上筛选,方法相同。2.基因缺失突变株△hmuU,△hmuV与△hmuU/△hmuV的遗传稳性和生长特性研究分别将构建的基因缺失突变株在体外连续传代培养20代,每隔5代进行PCR鉴定,结果证明基因缺失突变株在20代内均能够稳定遗传。在普通LB培养基(全营养条件)和铁营养限制条件下测定3株基因缺失株与亲本菌株的生长曲线,得出在全营养时3株基因缺失突变株与亲本株生长速度相似,在铁营养限制条件时,3株基因缺失突变株的生长速率低于亲本株,其中两株单基因缺失突变株生长速度较慢,双基因缺失突变株生长速度最慢。3.基因缺失突变株△hmuU,△hmuV与△hmuU/△hmuV的细胞粘附与侵入及抗吞噬试验肠外致病性大肠杆菌PCN033株基因缺失突变株△hmuU、△hmuV、△hmuU/△hmuV和亲本菌株分别与PAM细胞、RAW细胞和PK15细胞共培养,并在培养后不同时间用壮观霉素和氯霉素处理,然后收集细胞并裂解细胞,进行细菌平板计数,计算细胞吞噬菌量或侵入菌量。每个样品重复四次。对每个时间点3株基因缺失突变株与亲本菌株间的吞噬菌量和粘附与侵入菌量进行统计学分析,结果显示3h时,PAM细胞抗吞噬能力试验,3株基因缺失突变株与亲本菌株差异极显著(P<0.01)；RAW细胞抗吞噬能力试验,3株基因缺失突变株与亲本菌株间差异显著(P<0.05)。粘附与侵入能力试验,3株基因缺失突变株的能力比亲本株有所减弱,但差异分析不显著(P>0.05)。4.基因缺失突变株△hmuU,△hmuV与△hmuU/△hmuV对小鼠的感染试验将3种基因缺失突变株△hmuU,△hmuV与△hmuU/AhmuV分别用5.0×105CFU、5.0×106CFU、5.0×107CFU三个不同剂量腹腔注射感染各组小鼠,每小组5只小鼠使用一个感染剂量。并设一组为亲本菌株PCN033对照。感染后连续观察1周,记录各组小鼠死亡情况,根据寇氏(Korbor)法计算每个菌株的小鼠半数致死剂量(LDso)。结果显示两株单基因缺失株的LDso值为1.5x106CFU,双基因缺失株的LD50值为1.5x107CFU,亲本菌株的LD50值为9.5x105CFU。与亲本菌株相比,单基因缺失突变株毒力下降约2倍,双基因缺失突变株毒力下降约16倍。将攻毒后12h内死亡的小鼠无菌解剖,分别采集肝,心,脾,肺,肾,脑等组织,称量,研磨后稀释涂平板计数,计算各组织载菌量。统计了5.0x106CFU和5.0x107CFU攻毒剂量组急性死亡小鼠的各组织载菌量,结果显示相同攻毒剂量的死亡小鼠,亲本菌株组组织分菌量最高,约是3株基因缺失突变株相同组织载菌量的5-10倍,单基因缺失突变株的分菌量较少,双基因缺失突变株的分菌量最少。