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神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)是流感病毒表面的糖蛋白之一,具有糖苷外切酶活性。NA在病毒的侵入和传播过程中起非常重要的作用。NA的主要作用是消除病毒颗粒表面及感染细胞表面的唾液酸,对病毒粒子的释放以及防止病毒粒子的聚集很重要,既能够降解流感病毒识别的宿主细胞上的受体—唾液酸残基；同时NA也具有免疫原性,其诱导机体产生的特异性抗体可以对同种病毒的攻击提供完全保护,并可对同亚型不同病毒株的攻击提供交叉保护。NA这一独特功能对防治禽流感病毒(AIV)具有重要的意义,使其成为国内外抗禽流感病毒研究的热点之一。Mx (myxo-virus resistance)基因,即抗粘液病毒基因,是由干扰素诱导表达的抗病毒蛋白家族中的成员之一,经Ⅰ型(α/β)和Ⅲ型(λ)干扰素、双股RNA或病毒诱导可产生抗病毒Mx蛋白,具有独特的抗禽流感病毒作用。有研究表明鸡Mx蛋白631位氨基酸多肽性与其抗病毒活性密切相关,当其为天冬酰胺时Mx蛋白有抗病毒活性。本实验研究的目的在于尝试将被动诱导的Mx蛋白基因与可发生主动诱导免疫的NA基因,分别单独构建表达载体以及构建Mx-NA双基因表达载体,比较NA基因、Mx基因、Mx-NA联合基因表达产物的抗病效果。利用睾丸注射法将构建的上述双基因共表达的重组载体导入体内生产转基因鸡,为培育抗禽流感转基因鸡开辟新途径。主要内容如下：1.NA基因和Mx基因的克隆、序列分析及重组真核双表达载体构建。设计合成NA基因和Mx基因特异性引物,采用PCR方法克隆出鸡源H5N1型禽流感病毒NA基因和中国狼山鸡Mx基因的cDNA。将NA基因和Mx基因扩增产物克隆至pMD19-T Vector中,酶切与测序结果表明pMD19-T-NA(?)(?)nPMD19-T-Mx构建正确。然后将NA和Mx基因克隆至真核表达载体PVITRO2中,构建单基因真核表达载体PVITRO2-Mx和PVITRO2-NA以及双基因表达载体PVITRO2-Mx-NA,酶切与测序结果均表明单基因和双基因表达载体构建正确。序列分析结果表明：①鸡源H5N1型禽流感病毒NA基因与人源H5N1型同源性最高,其所编码的亲水性NA蛋白主要分布在细胞质及质膜附近,属于分泌型跨膜蛋白。②狼山鸡与肉鸡的Mx基因同源性最高,Mx蛋白为亲水性的非分泌型蛋白,主要分布在细胞质中。2.体外重组"PVITRO2-Mx-NA"的表达及其亚细胞定位研究。首先本试验利用Mx蛋白真核表达载体pcDNA3.0-Mx免疫BALB/C小鼠,初步制备了抗Mx蛋白的抗体血清,并且确定了该抗体血清的效价为1：100。用电转染法介导表达载体PVITRO2-Mx-NA转染NIH-3T3细胞系,48h后进行筛选,之后提取所获得阳性细胞的总RNA。通过RT-PCR以及间接免疫荧光方法(IFA)鉴定该联合蛋白在细胞中的表达情况。荧光倒置显微镜下观察,重组Mx和NA蛋白均分布在细胞质内,细胞核内无荧光,说明重组载体pVITRO2-Mx-NA成功表达了重组Mx和NA蛋白。这为建立稳定表达细胞系及制备转基因鸡奠定基础。3.重组表达载体" PVITRO2-Mx-NA "抗病活性的研究。通过电转染法介导PVITRO2-Mx-NA转染鸡成纤维(CEF)细胞,48h后提取CEF细胞的总RNA并通过RT-PCR法检测Mx和NA基因的表达。然后采用微量细胞病变抑制法CEF—NDV系统测定鸡重组Mx蛋白和NA蛋白的联合抗病毒作用,并且设立单基因抗病毒组,对各组实验数据进行统计分析来研究各实验组抗病毒效果的差异；同时我们使用已制备的Mx和NA蛋白抗体进行攻毒实验作为阳性对照。两种蛋白对新城疫病毒(NDV)感染的联合抑制能力显示：联合应用Mx和NA蛋白可以有效的提高细胞对新城疫病毒的抵抗力,并且优于单基因的抗病效果；两种抗体联合使用攻毒的实验结果也同时验证了这一结果。4.睾丸注射法制备抗病转基因鸡的研究。采用脂质体转染法,将线性化的重组载体PVITRO2-Mx-NA通过随机打点注射入性成熟的公鸡睾丸内。首次注射1周后重复注射1次,并于注射后25d,50d,60d,70d采集其精液,将精液基因组PCR阳性个体的精液用于人工授精母鸡生产F1代,采用常规PCR、基因组PCR及Western blot技术检测外源Mx和NA基因在公鸡体内稳定整合的能力。结果表明,本实验中所使用的6只公鸡经PCR检测阳性率为33.33%；F1代血液基因组PCR阳性率达31.43%,Western blot检测阳性率达28.6%,初步证实外源联合NA和Mx基因能整合到鸡基因组中并能遗传给下一代