蛇毒凝血因子IX/X结合蛋白家族是一类具有特殊性质的蛋白质,广泛存在于各种蝰科蛇毒中,能够与血液中凝血因子IX/凝血因子X结合,因而具有显著的抗凝血活性。本文主要讲述了江浙蝮蛇毒凝血因子IX/X结合蛋白的分离纯化、作用机理和金属离子对它的活性、功能、构象和结构稳定性的影响。全文分为四章。第一章:概述了凝血系统和凝血因子IX/X结合蛋白的研究进展,对本文中应用的一些实验手段进行了概述。通过这一章可以对凝血系统的基本组成、血液凝血原理、凝血因子种类和作用以及凝血因子IX/X结合蛋白的研究简史有个提纲挈领的认识,并对研究金属蛋白的几种常用手段有初步了解。第二章:我们通过离子交换层析、分子筛凝胶过滤等方法从江浙蝮蛇毒中提纯出凝血因子IX结合蛋白(AHP IX-bp);并且通过凝胶电泳、毛细管电泳、基质辅助激光解吸飞行时间质谱等方法对分离到的AHP IX-bp的纯度和分子量等进行了分析。第三章:以前研究表明,江浙蝮蛇毒凝血因子IX结合蛋白(AHP IX-bp)只在锌离子作用下与凝血因子IX结合,不与凝血因子X结合。我们通过模拟血液中的金属离子环境以及聚丙烯酰胺凝胶电泳和表面等离子体共振两种手段,发现在镁离子存在条件下,AHP IX-bp也能够与凝血因子X结合。该蛋白不仅在锌离子作用下与凝血因子IX结合,也在镁离子作用下与凝血因子X结合。AHP IX-bp在血液中有两个作用靶点。因此,我们把AHP IX-bp更名为江浙蝮蛇毒凝血因子IX/X结合蛋白(AHP IX/X-bp)。锌离子和钙离子不能诱导AHP IX/X-bp与凝血因子X结合。我们还通过等温滴定微量热的手段测得镁离子不与AHP IX/X-bp结合,镁离子通过调节凝血因子X的结构使AHP IX/X-bp和凝血因子X结合。第四章:通过等温滴定微量热等手段研究了天然AHP IX/X-bp所含的两种金属离子(钙离子和锌离子)与AHP IX/X-bp的结合反应性质,并用内源荧光和差示扫描微量热法研究了钙离子和锌离子对该蛋白的结构和稳定性的影响。结果表明,AHP IX/X-bp有两个金属离子结合位点。其中一个位点是钙离子特异性结合位点,对锌离子亲和性低;另一个位点是锌离子特异性结合位点,对钙离子亲和性低。内源荧光和差示扫描微量热法的结果表明虽然钙离子和锌离子分别属于碱土和过渡金属离子,它们都能够显著提高AHP IX/X-bp的结构稳定性。在体外,AHP IX/X-bp通过在锌离子和镁离子作用下与凝血因子IX/X结合抑制凝血反应。在体内,AHP IX/X-bp主要通过在镁离子作用下与凝血因子X结合抑制凝血反应。第五章:通过亲和层析的方法对猪血浆中的凝血因子IX和凝血因子X进行尝试性分离纯化。通过电喷雾质谱蛋白质鉴定和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现,分离的得到的组分中含有凝血因子IX,但是仍旧存在多种杂质成分,分离方法仍需进一步改进。