论文部分内容阅读
(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酷((S)-CHBE)是一种重要的手性砌块,可被用于HGM-CoA还原酶抑制剂类药物的合成。近年来,随着生物工程技术的发展,人们已经开发出了多种生物催化剂不对称催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)合成(S)-CHBE的过程。利用生物法合成手性化合物的过程简单,催化效率高,反应条件温和,是一种重要的合成方法。利用生物法实现手性化合物高效催化的关键是生物催化剂的制备,本文首先从一份受化工污染的土样中筛选到一株对底物COBE具有严格对映体选择性的菌株,通过气相方法检测发现催化的产物为(S)-CHBE,其对映体过量值达到99%。通过对该菌菌体形态学观察,生理生化鉴定、16S rDNA鉴定确定筛选到的菌株为庆笙红球菌(Rhodococcus qingsheng),命名为 Rhodococcus qingsheng ZJB-12028,该菌属在催化底物COBE合成(S)-CHBE中未见报道。其次,通过实验优化获得菌体最佳产酶条件,首先通过单因素法探究培养基的碳源、氮源、磷源、金属离子以及菌体培养过程中的培养温度、pH、接种量和装液量对酶活和生物量的影响。实验结果证明葡萄糖为产酶培养基的最佳碳源,酵母粉为最佳氮源,而额外添加磷源和大部分金属离子对酶活没有明显的影响,但是Cu2+会严重抑制羰基还原酶的活性。实验发现,碳源添加量、氮源添加量、培养温度和pH对羰基还原酶的催化活性有显著影响,因此后续实验设计了一个优化模型SVM-PSO对显著影响羰基还原酶的四种因素进行优化。最终确定R.qingsheng ZJB-12028的最佳产酶培养条件为:葡萄糖47.7 g/L,酵母粉28.7 g/L,培养温度32℃,初始培养pH值7.4,装液量80 mL/500 mL,接种量为6%,最终酶活达到283.87 U/L,生物量达到11.27 g/L,比优化前分别提高了 9.77%和10.50%。以R.qingsheng ZJB-12028静息细胞为催化剂,考察了催化剂不对称催化合成(S)-CHBE的最佳条件,确定最佳催化反应条件为:反应温度30℃,反应体系为pH 7.0磷酸盐缓冲体系,以葡萄糖为辅助底物,最适添加量为20.0 g/L,采用底物分批添加的方式,最终将240 mmol/L的底物COBE分4次添加到500 mL的反应体系当中,最终产物的产率达到76.73%,产物(S)-CHBE终浓度达到184.15 mmol/L。同时考察了催化剂在低温条件下的保藏稳定性,实验发现菌体在4℃保藏一周,酶活下降28.06%,证明菌体可以在低温下进行短时间保藏。最后对R.qingsheng ZJB-12028中的羰基还原酶进行分离纯化,从R.qingsheng ZJB-12028菌体出发,经过超声破碎、盐析、DEAE离子交换层析、丁基疏水层析、羟基磷灰石层析等蛋白质纯化技术使羰基还原酶的纯化倍数达到4.6倍,酶回收率为6.91%。同时考察了羰基还原酶的酶学特性,通过实验证明筛选到的羰基还原酶的最佳的pH值为6.5,最适催化温度为45℃。酶在最适的pH条件下的催化性能稳定,但是随着温度的升高,羰基还原酶的半衰期逐渐缩短,说明该酶在高温下容易失活。同时通过实验发现羰基还原酶对Fe3+、Ag+和Cu2+三种金属离子较为敏感,短时间的接触即会严重抑制酶的催化活性。实验测定羰基还原酶在催化底物COBE时,米氏常数Km和最大反应速率Vm值分别为 8.991 mmol/L,0.359 mmol/(mg·min)。