目的:1.检测高尔基体堆叠蛋白65(GRASP65)在卵巢浆液性和粘液性肿瘤组织中的表达水平,探讨GRASP65蛋白表达与临床病理指标之间的关系。2.探讨二氢杨梅素(DHM)对卵巢癌SKOV3和A2780细胞的侵袭及迁移能力、细胞凋亡、细胞自噬及超微结构等方面的影响,明确DHM通过JNK和ERK通路调控GRASP65发挥抗卵巢癌作用的机制。3.探讨DHM干预处理对卵巢癌裸鼠的体内移植瘤生长的抑制作用及机制。方法:1.收集湖北民族大学附属民大医院收治确诊后进行手术切除、经病理诊断为卵巢肿瘤的患者118例,取患者术后肿瘤组织的石蜡标本,及6例卵巢浆液性癌患者术后的新鲜癌组织及癌旁组织为研究对象,采用免疫组织化学染色(IHC)和蛋白免疫印迹技术(Western blot,WB)检测GRASP65蛋白在组织细胞内的阳性定位及表达水平,并分析GRASP65表达与肿瘤患者的临床病理各指标之间的关系。2.不同浓度的DHM分别处理卵巢癌SKOV3和A2780细胞至既定时间后,采用CCK8法检测各组细胞的活力;划痕(Wound healing)实验和Transwell分析癌细胞迁移及侵袭能力的变化;流式细胞术(FCM)分析各组细胞的凋亡率;免疫荧光染色(IF)检测DHM处理后各组细胞内GRASP65蛋白和促凋亡蛋白Caspase-3的定位表达情况;WB检测促凋亡蛋白Bax、Caspase-3及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平,及MAPK通路蛋白的表达;采用si RNA转染下调GRASP65的表达,及GRASP65过表达质粒上调其表达,再分别用DHM干预处理,检测细胞活力、迁移能力及凋亡的改变;JNK和ERK通路抑制剂分别预处理后,再用DHM干预,WB检测细胞内p-JNK/ERK、JNK/ERK蛋白、GRASP65蛋白及Caspase-3的表达水平;透射电子显微镜(TEM)观察DHM处理后细胞内高尔基体等的结构改变及自噬水平的变化。3.构建SKOV3和A2780两种裸鼠皮下移植瘤的模型,分别用DHM混悬液及生理盐水对照进行腹腔注射来干预处理,检测裸鼠皮下瘤的体积大小、肿瘤重量、及裸鼠肝肾功能等指标;并取瘤组织,采用IHC和WB检测分析促凋亡蛋白Caspase-3及自噬相关蛋白LC3的表达,及检测GRASP65蛋白的表达水平;TEM观察DHM处理对瘤组织细胞内的高尔基体结构及自噬体的影响。结果:1.118例卵巢肿瘤患者中包括良性肿瘤82例、交界性肿瘤14例、及恶性肿瘤22例;从组织学的类型来分,浆液来源的肿瘤65例、粘液来源的48例、及特殊类型的5例。石蜡组织标本的IHC结果显示GRASP65表达呈棕黄或棕褐色、细颗粒样,分散于胞浆内。统计分析结果显示,与良性肿瘤组织相比,GRASP65蛋白在卵巢交界性、恶性肿瘤中高表达(χ2=12.57,P<0.01);且在粘液性瘤内的表达高于浆液性瘤(χ2=5.23,P<0.05)。六例卵巢浆液性癌患者手术后切除的新鲜组织标本中,WB检测同一个体来源的癌及癌旁组织中GRASP65表达的情况,结果显示与癌旁组织相比,癌组织内GRASP65蛋白的表达明显增加(P<0.01)。上述结果表明GRASP65表达的异常可能与卵巢肿瘤的性质及组织学类型有关。2.DHM(0,10,20,40,80,120,160,240,320μM)处理两种卵巢癌细胞(SKOV3和A2780),发现DHM处理可降低癌细胞的活力、抑制细胞迁移和侵袭的能力、及诱导细胞凋亡,且有一定的剂量性关系。根据计算所得DHM对SKOV3和A2780细胞的IC50值,后续实验中选择干预两种细胞48h时,DHM作用浓度分别为120μM和80μM。3.DHM分别处理SKOV3和A2780细胞后,检测其对细胞内GRASP65蛋白水平的影响,WB结果显示DHM可降低两种细胞内GRASP65的表达(P<0.05及0.01);IF结果显示DHM处理后细胞内GRASP65的荧光染色强度减弱、且分散,形态上与高尔基体碎裂相似。Caspase-3特异性抑制剂预处理细胞30min后,再用DHM干预,WB分析结果显示在两种癌细胞中,与单独DHM处理相比,预处理后均可降低DHM诱导的Caspase-3的活化(P<0.01),伴GRASP65表达水平增加(P<0.05及0.01);FCM结果亦显示,与单独DHM处理相比,Caspase-3抑制剂预处理可降低细胞凋亡率(P<0.01),表明DHM可能通过激活Caspase-3、进而引起GRASP65蛋白的裂解和下调,且Caspase-3的活化对DHM引起的GRASP65下调有重要作用。4.si RNA转染下调A2780细胞内GRASP65的表达,发现癌细胞的活力下降、迁移能力降低、及细胞凋亡率增加。WB及FCM结果显示,与单独DHM处理相比,DHM与si GRASP65转染共处理对细胞活力和迁移能力的抑制、及细胞凋亡的诱导均有相加作用。相反的是,过表达GRASP65质粒转染与DHM共处理可减弱DHM对细胞活力和迁移能力的抑制、及细胞凋亡的诱导作用。5.40,80及120μM DHM处理A2780细胞可呈剂量依赖性增加p-JNK和p-ERK的水平(P<0.05及0.01),而对p-p38水平无明显影响(P>0.05),提示ERK和JNK信号通路可能参与了DHM的抗卵巢癌作用。与空白对照组相比,si GRASP65组内p-JNK和p-ERK水平无显著性变化;而且DHM组与DHM+si GRASP65共处理组之间的p-JNK和p-ERK水平亦无明显差异,表明下调GRASP65表达对各组细胞内的p-JNK和p-ERK水平没有明显影响。采用JNK和ERK通路的抑制剂SP600125和U0126,分别预处理A2780细胞2 h后,再用DHM干预,WB结果发现与单独DHM处理组相比,两种抑制剂与DHM共处理均可抑制DHM诱导的Caspase-3的激活(P<0.05),伴GRASP65水平的增加(P均<0.01),及p-JNK和p-ERK水平的下降(P均<0.01)。上述结果表明DHM处理可能通过JNK和ERK通路激活Caspase-3,进而下调GRASP65的水平,来促进卵巢癌细胞凋亡,而且GRASP65可能处在DHM诱导JNK和ERK通路活化的下游。6.TEM观察DHM处理A2780后细胞内高尔基体等形态结构的变化,发现DHM处理组、si GRASP65组、及共处理组的细胞内均可见到高尔基体水肿、碎裂样改变,另有较多自噬体形成,表明DHM处理可能通过下调GRASP65引起高尔基体碎裂、诱导细胞凋亡,同时提高了癌细胞内的自噬水平。7.SKOV3和A2780细胞分别种植至裸鼠皮下,构建卵巢癌移植瘤的模型,再用DHM混悬液腹腔注射处理,分别设立生理盐水为对照组,结果发现DHM处理对各组裸鼠肝肾功能无明显影响。与对照组相比,DHM处理可抑制两种模型鼠体内肿瘤的生长(P均<0.01);IHC及WB分析结果显示DHM处理后可下调瘤组织内的GRASP65表达水平(P均<0.05)、上调促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的水平及自噬相关蛋白LC3II的水平(P均<0.05);TEM结果发现DHM处理裸鼠后,瘤组织内可见高尔基体肿胀及自噬体数量明显增多,伴有内质网明显水肿、扩张等现象。结论:1.GRASP65蛋白在卵巢交界性、恶性肿瘤组织中表达增加,且GRASP65的高表达与卵巢肿瘤的性质及组织学类型有关。2.DHM通过激活JNK和ERK通路下调GRASP65表达,引起卵巢癌细胞内的高尔基体水肿、碎裂改变及细胞凋亡,从而发挥抗卵巢癌作用。