目的今年年初世界卫生组织发布的《2009年全球结核病控制报告》中指出,目前全球结核菌感染人数超过20亿,其中结核病患者或可能发病者约占1/10。我国约有5.5亿人已经感染结核杆菌,现有活动性肺结核患者约450万。全世界耐多药/广泛耐药结核病例数约为50万,我国是其中总数排名前五位的高负担国家之一。目前卡介苗（BCG）作为唯一临床使用的疫苗,预防效果并不稳定。因此研制新疫苗成为当前结核病防治的首要任务。BCG作为一种减毒活疫苗,除用于预防结核病外,也作为一种强的非特异性细胞免疫刺激剂,用于肿瘤（如膀胱癌等）的治疗。研究还证明BCG与动物和人等一些肿瘤细胞间存在着共同抗原。但BCG灌注治疗膀胱癌的毒副作用也常使部分患者因不能耐受其副作用而不得不终止BCG灌注治疗。Ag85复合物是由A、B、C三种成分组成,存在于结核杆菌和BCG等分枝杆菌的细胞壁及培养滤液中。在BCG Ag85的三种成分中Ag85A所占的比例最大,而且多项研究表明Ag85A抗原是一种十分重要的免疫保护性抗原。近年来的研究表明,Ag85A可使小鼠脾CD8⁺CTL的细胞毒活性增强,可刺激机体Th1型细胞因子,如IL-2、IFN-γ、TNF-α等的产生水平升高;促进NK细胞、单核-巨噬细胞等对肿瘤细胞的杀伤作用。但由于结核分枝杆菌生长缓慢,并且需要较复杂生长条件,从细菌菌体中提取Ag85A蛋白易发生凝集和降解,更难于纯化。同时Ag85A作为一种异种蛋白质长期使用仍有可能发生变态反应等不良反应。1996年Huygen等首次报道用结核分支杆菌Ag85A编码基因的质粒DNA经肌肉接种途径免疫小鼠,可诱导小鼠产生很强的细胞和体液免疫应答,抵御结核分支杆菌的攻击。自90年代初首次报道应用DNA疫苗进行免疫以来,大量的研究已经显示了DNA疫苗的实际效果和广阔的应用前景。近些年来已将DNA疫苗的应用研究扩展到了抗感染、抗肿瘤、治疗变态反应性疾病和自身免疫病及降低组织器官移植排斥反应等多个领域。DNA疫苗可经多种途径（如粘膜、皮肤和肌肉等）和采用多种方式（如口服、喷雾和注射等）接种,依据所含目的基因及表达产物的不同可致机体产生免疫应答上调或下调及免疫应答的类型不同。经口服进行DNA疫苗接种是一种简便、易于被人们接受的方式。但口服DNA疫苗在黏膜局部的表达情况和诱导局部的免疫细胞,特别是IEL的变化,目前尚不清楚。为此,我们采用经口灌饲的方式给小鼠投与自制的Ag85A DNA疫苗,在观察肠道局部细胞表达的基础七,对其诱导的IEL亚群及生物学功能的变化进行了研究,目的是探讨经口服途径接种分枝杆菌Ag85A DNA疫苗有否预防和治疗效应。材料与方法1、重组质粒pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A的构建采用PCR技术扩增Ag85A基因片段,与真核表达pcDNA3.1/myc-hisA质粒载体连接成重组质粒pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A,再转化至大肠杆菌DH5α,于-70℃保存备用。2、Ag85A DNA疫苗的制备采用V-gene无内毒素型超纯质粒DNA制备试剂盒分离纯化pcDNA3.1/mychisA-Ag85A重组质粒。采用电穿孔转化法将pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重组质粒转化到减毒伤寒沙门氏菌ST7207菌苗,经大量培养细菌制成由减毒伤寒菌苗携带的Ag85ADNA疫苗。同时将纯化的pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重组质粒用脂质LipofectamineTM 2000包裹,制成脂质体包裹的Ag85A DNA疫苗。3、动物分组与免疫检测Ag85A DNA疫苗诱导小鼠肠IEL亚群的变化:将C57BL/6小鼠随机分成3组,即重组质粒组、空质粒组和正常对照组。每只鼠免疫3次,前二次免疫间隔10天,后二次免疫间隔14天。重组质粒组前二次经口灌饲脂质体包裹Ag85ADNA疫苗,后一次经口灌饲减毒伤寒菌-Ag85ADNA疫苗。同样方法分别给后二组小鼠口灌饲减毒伤寒菌-pcDNA3.1菌和生理盐水作为对照。末次免疫后3周检测IEL亚群。检测Ag85A DNA疫苗诱导小鼠肠IEL的生物学功能变化:将C57BL/6小鼠随机分成3组,即重组质粒组、空质粒组和正常对照组。每只鼠免疫2次,间隔2周。重组质粒组经口灌饲减毒伤寒杆菌-Ag85A DNA疫苗菌液;空质粒组和正常对照组以同样方法分别经口灌饲减毒伤寒杆菌-V1Jns.tPA菌和生理盐水。末次免疫后的第1、3、6、9和12d处死小鼠进行IEL生物学功能检测。4、IEL的分离去小鼠全部小肠,翻转,截成数段,清洗干净;加消化液于37℃恒温振荡;静置片刻后,去含游离细胞的上层液通过纱布及玻璃棉柱,再用淋巴细胞分层液分离。5、IEL细胞亚群的检测采用流式细胞分析仪分析测定T细胞亚群。6、IEL的培养将IEL调成所需细胞浓度,加终浓度为5μg/ml Ag85A蛋白孵育48小时,离心收集培养上清液,用于细胞因子的测定。7、细胞因子的检测采用生物活性测定法（依赖细胞株检测法）检测IEL培养上清中的IL-2;采用双抗体夹心ELISA法检测IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β。8、FasL分子表达的检测提取IEL总RNA,采用半定量RT-PCR技术检测FasL mRNA的表达。FasLmRNA的表达水平用所测定的扩增产物FasL的电泳条带密度与β-actin电泳条带密度的比值表示。9、细胞毒活性检测采用放射核素释⁵¹Cr释放法。将IEL先用丝裂霉素处理的转染Ag85A cDNA的p815细胞刺激,然后与靶细胞(⁵¹Cr标记的P815细胞)共孵育一定时间,用γ计数仪测定培养上清中的放射活性cpm值。计算细胞毒活性。计算公式:细胞毒活性（%）=（IEL孔释放cpm值-自然释放孔cpm值/最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值）x100%10、细胞增殖活性检测采用放射性核素[³H]thymidine摄入法检测IEL的增殖活性。将IEL用终浓度为5μg/mlAg85A蛋白刺激培养,培养过程中加入[³H]thymidine,将培养的细胞收集细胞至玻璃纤维滤膜上,将玻璃纤维滤膜放入液体闪烁液内,用β液体闪烁计数仪测定cpm值。计算刺激指数公式:刺激指数=实验孔cpm值-空白对照孔cpm值/空白对照孔cpm值。11、肠组织SIgA水平测定采用SIgA放免分析试剂盒测定肠组织SIgA水平。剪取小肠中段约5cm,纵行剖开,洗净剪碎,每克肠组织加入10ml生理盐水,制成匀浆,离心取上清液。然后按说明书进行测定。结果1、转化pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A和pcDNA3.1/myc-hisA减毒伤寒沙门氏菌成功。2、IEL亚群的检测结果流式细胞分析技术检测结果显示,重组质粒组的CD3⁺IEL数量为（5.89±1.15）x10⁶,空质粒组为（5.55±0.97）x10⁶,正常对照组为（5.32±1.10 x10⁶）。各组间未见明显差异（P>0.05）。重组质粒组的CD3⁺CD4⁺IEL比例为39.65±5.46%,空质粒组为39.78±4.32%,正常对照组为38.92±3.46%。各组间未见明显差异（P>0.05）。重组质粒组的CD3⁺CD8αβ⁺IEL和CD3⁺CD8αα⁺IEL比例分别为27.25±1.98%和50.75±4.82%,较空质粒组（21.37±3.82%和41.08±3.98%）和正常对照组（19.80±0.82%和39.35±4.32%）均见明显差异（P<0.05）。重组质粒组的TCRαβ⁺IEL比例为42.73±2.25%,空质粒组为44.24±2.01%,正常对照组为42.38±1.34%。各组间未见明显差异（P>0.05）。重组质粒组的TCRγδ⁺IEL比例为38.21±2.82%,较空质粒组（32.08±0.98%）和正常对照组（31.35±4.32%）均见明显差异（P<0.05）。CD40L⁺IEL和CD45⁺IEL亚群的检测结果各组间未见明显差异（P>0.05）。FasL⁺IEL亚群的检测结果,重组质粒组较空质粒组和正常对照组显著降低,P<0.01,后二组间未见明显差异。CD103⁺IEL亚群的检测结果,重组质粒组较空质粒组和正常对照组显著升高,P<0.01,后二组间未见明显差异。CD25⁺IEL和Foxp3⁺IEL亚群的检测结果,重组质粒组较空质粒组和正常对照组显著降低,P<0.01,后二组间未见明显差异。CD19⁺IEL亚群的检测结果各组间未见明显差异（P>0.05）。3、IEL细胞培养上清中细胞因子检测结果采用依赖细胞株生物学活性测定法检测IEL培养上清中IL-2水平的结果显示,重组质粒组小鼠于末次免疫后第6天即出现明显升高（6679±793cpm）,第9天水平最高（10,806±1,293cpm）,与空质粒组（1,075±186）和正常对照组（308±59）比较差异显著（P<0.01）。用ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β水平的结果显示,重组质粒组小鼠于末次免疫后第6天IEL的IFN-γ水平（198.78±12.35 pg/ml）,与空质粒组（75.88±6.03 pg/ml）和正常对照组（53.56±4.85）比较差异显著（P<0.01）。重组质粒组第6天IL-10出现明显升高（35.76±2.78pg/ml）,与空质粒组（13.98±1.12 pg/ml）和正常对照组比较差异显著（P<0.05）。TGF-β也于第6天达高峰（116.56±2.33 pg/ml）,与空质粒组（19.54±2.05pg/ml）和正常对照组（21.66±0.88 pg/ml）比较均差异显著（P<0.01）。空质粒组和正常对照组之间IL-10和TGF-β的检测结果均未见有意义的差异（P>0.05）。IL-4水平在各组间均未见明显差异（P>0.05）。4、FasL mRNA的表达结果通过半定量RT-PCR技术检测小鼠iIEL FasL mRNA的表达结果显示,末次免疫后第8天,重组质粒组FasL mRNA平均表达水平（0.61±0.25）,与空质粒组（0.28±0.087）和正常对照组（0.19±0.13）均有升高（P<0.05）;空质粒组与正常对照组之间未见有意义的变化（P>0.05）。5、IEL特异性细胞毒活性检测结果检测末次免疫后第9天IEL特异性细胞毒活性,结果显示Ag85A重组质粒免疫组IEL细胞毒活性为67.35±5.56%,空载体组为14.89±3.73%和生理盐水组为10.26±3.3 1%。前组较后2组有显著增高（P<0.05）,而后2组组之间也无显著意义（P>0.05）。6、IEL细胞增殖检测结果应用[³H]thymidine参入法检测IEL经Ag85A特异性刺激后的增殖活性,结果显示测得的cpm值在重组质粒组所检测的时间点均有升高,末次免疫后第6天（3608±372）和第9天（3536±298）cpm值更高,与第6天测得的空载体组（598±79）和正常对照组（675±67）比较差异显著（P<0.01）,而后2组组之间也无显著意义（P>0.05）。提示IEL经Ag85A特异性刺激后的增殖活性显著升高。7、肠组织中SIgA产生水平检测结果应用放射免疫法测定小鼠肠组织中SIgA含量,结果显示重组质粒组SIgA的含量为0.38±0.05 ng/ml,空质粒组为0.24±0.04 ng/ml,正常对照组为0.2±0.09ng/ml。重组质粒组较较空质粒组和正常对照组为呈现有意义的升（P<0.05）。而空质粒组和正常对照组之间未见有意义的区别（P>0.05）。结论1、转化pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A和pcDNA3.1/myc-hisA减毒伤寒沙门氏菌成功。2、经口接种Ag85A DNA疫苗诱导了CD3⁺CD8αβ⁺IEL、CD3⁺CD8αα⁺IEL、CD3⁺TCRγδ⁺IEL和CD103⁺IEL的比例升高,CD25⁺IEL和Foxp3⁺IEL比例降低,CD3⁺IEL和CD3⁺TCRαβ⁺IEL的数量未见明显变化,提示经口途径投与Ag85A DNA疫苗可能主要诱导CD8⁺CTL介导的细胞免疫应答,而不是诱导免疫耐受。3、经口接种Ag85A DNA疫苗可诱导IEL的细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10和TGF-β分泌水平增加;IL-4水平无变化;特异性细胞毒活性增强;FasL表达增加;IEL特异性增殖活性增强;SIgA分泌水平增加。提示主要诱导Th1型细胞因子介导的细胞免疫应答。