研究背景糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是由于高血糖导致内分泌代谢紊乱,造成包括骨骼、神经、肾脏等多器官多系统损伤的全身性疾病。糖尿病患者胰岛素相对或绝对缺乏,胰岛素样生长因子缺乏,矿物质组织代谢紊乱。因其肌力下降,骨质疏松,糖尿病患者易发生骨折,而且由于糖尿病患者骨质减少,骨矿物质减少等因素导致本身骨折延迟愈合或骨不连发生率很高。糖尿病患者骨折延迟愈合可造成神经麻痹、肌肉萎缩、肢端坏疽、褥疮、泌尿系感染等后果,甚至引发局部或全身性感染。糖尿病骨折治疗效果欠佳且并发症严重,因此如何治疗糖尿病骨折日益受到重视。而近期研究表明,影响骨代谢的细胞因子在骨折愈合中起到关键性作用。骨折可能是最适合采用基因疗法治疗的疾病之一,因其只需一种或几种相关生长因子基因在骨折局部短暂表达,即可有效的促进骨折愈合。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)家族成员BMP-2在骨折愈合过程中所起的作用尤为显著,是骨愈合的关键因子之一。BMP-2可诱导骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)向成骨细胞表型分化,促进软骨细胞和骨细胞成熟。BMP-2可特异性的将小鼠成肌细胞系细胞转化为成骨细胞系细胞；目前认为成骨细胞BMP-2的含量可反应成骨细胞的骨形成能力。胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1)是另一促进骨愈合的重要生物活性因子。IGF-1在骨折后期增殖软骨细胞和成熟软骨中的表达,可延缓软骨细胞向终末方向的分化,在维持软骨细胞表型中发挥一定作用,推测IGF-1在骨质疏松性骨折愈合过程中起重要调节作用。但目前应用生长因子治疗存在诸多问题,如免疫排斥,提取困难,给患者经济加重负担,因而尚存在有待突破之处。而骨折延迟愈合选择生物活性因子治疗是未来研究的重要方向,从众多因子中选择最佳的生长因子组合并选择最优的治疗方式,可为有效、安全的提高治疗效果提供临床选择方案。BMP-2、IGF-1在促进骨折愈合过程种的作用得到了肯定,然而它们在糖尿病骨折愈合过程中扮演什么角色呢、又有什么样的变化规律呢?我们拟通过糖尿病大鼠骨折动物实验,观察骨折愈合过程中骨折局部的BMP-2、IGF-1含量变化以及骨折的愈合过程,从而推断糖尿病骨折延迟愈合与二者的关系。BMP-、IGF-1是促进BMSCs增殖分化的重要生长因子,因此我们采用基因工程将BMP-2、IGF-1基因转染BMSCs,并观察高糖环境下转染后的BMSCs种子细胞基因表达变化、增殖分化情况,进一步探讨能否用基因治疗的方法改变糖尿病骨折延迟愈合,探讨BMP-2、IGF-1基因转导相互作用,为糖尿病骨折延迟愈合找到新的治疗方法以及为预防其产生提供理论基础和参考策略。研究方法本课题分三个步骤序贯研究,具体方案如下：1.动物实验：糖尿病大鼠与非糖尿病大鼠骨折模型的建立；不同时间点两组大鼠骨折愈合情况观察、血清中BMP-2、IGF-1测定,分析糖尿病骨折延迟愈合可能的影响因素。(1)Wistar雄性大鼠,随机数字表法随机分为实验组和对照组,实验组腹腔内注射链脲佐菌素,按标准糖尿病大鼠模型指标选取糖尿病大鼠。所有大鼠水合氯醛腹腔麻醉下切开显露左侧胫骨,线锯锯断胫骨,关闭切口,然后进行复位夹板外固定。(2)术后第1、2、3、4、6周分别门静脉静脉取血,高速离心后取血清,放置于-20℃冰箱内保存。处死大鼠后,检测骨密度和最大横截面积,切开取骨折端骨痂甲醛固定、脱钙、酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋,切片、HE染色,分析骨折愈合情况。(3)Elisa法检测血清BMP-2、IGF-1表达。(4)所得数据经统计学软件分析比较,得出相应结论。2.细胞培养：利用基因工程将BMP-2、IGF-1目的基因转染BMSCs,在高糖环境下观察BMSCs增殖分化情况。(1)构建BMP-2、IGF-1质粒载体。(2) BMSCs的分离纯化：抽取健康Wistar大鼠股骨、胫骨骨髓,采取密度离心法和贴壁筛选法分离纯化BMSCs。(3)基因转染：取BMSCs,转染BMP-2、IGF-1目的基因,分为对照组(不含目的基因)、BMP-2组、IGF-1组、BMP-2及IGF-1组。(4)各组分别在高糖DMEM培养基和正常糖含量培养基中,37度、5%C02、湿度饱和的培养箱中培养。(5)分别定量RT-PCR检测培养5天,10天BMSCs的BMP-2,IGF-1mRNA表达。(6) Western-blot法检测各组转染后BMP-2、IGF-1蛋白表达。(7)所得数据经统计学软件分析比较,得出相应结论。3.动物实验：重新制备糖尿病大鼠骨折模型将含有BMP-2、IGF-1目的基因的种子细胞BMSCs注射到骨折局部,检测不同时间点骨折局部BMP-2、IGF-1表达情况,观察骨折愈合情况。(1)构建携带BMP-2、IGF-1目的基因的种子细胞BMSCs。(2)糖尿病大鼠骨折模型制备同上。(3)将BMP-2和IGF-1共转染的BMSCs局部注射糖尿病大鼠骨折局部。(4)术后第1、2、3、4、6周,处死大鼠后,检测观察骨密度和最大横截面积,切开取骨折端骨痂甲醛固定、脱钙、酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋,切片、HE染色,分析骨折愈合情况。(5) Elisa法检测血清BMP-2、IGF-1表达。(6)ALP活性定量测定,以判断成骨细胞变化。(7)分析比较数据,得出结论。研究结果1糖尿病大鼠经链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)诱导后血糖值均高于16.7mmol/L,尿糖出现+++以上,出现多饮、多食,活动减少,反应迟钝,皮毛松散,且症状随时间延长而加重,骨折1周后精神状况有所缓解及活动增加,证实成功制备糖尿病大鼠模型。2糖尿病大鼠组骨痂局部骨密度虽有所增加,但与正常对照组相比,增加幅度明显低,差异具备显著性(P<0.05),且随着时间的延长,差异显著性进一步增加。3糖尿病大鼠组骨痂最大横截面积明显大于正常对照组,差异具备显著性(P<0.05),且随着时间的延长,差异显著性进一步增加。4组织学结果显示术后各时间点糖尿病组较对照组大鼠骨折处愈合过程中骨痂软骨细胞肥大并且软骨细胞等成熟延迟,成骨细胞较少。5术后第1-3周BMP-2和IGF-1趋势相似,浓度逐步上升,且和对照组之比较具备显著差异,具有统计学意义(P<0.05)；随后二者浓度下降,但无统计学差异(P>0.05)。6高糖环境下,利用BMP-2和IGF-1分别转染和共转染BMSCs, BMP-2和IGF-1共转染组BMP-2和IGF-1的表达增高更加明显,较各单独转染组增高差异具有统计学意义(P<0.05)。7利用BMP-2和IGF-1共转染BMSCs基因局部治疗,骨密度以及骨痂最大横截面积得以显著改善(P<0.05)。组织学结果显示,治疗后,可有效增加成熟软骨细胞分化和成骨细胞增殖,显著促进骨折愈合。8基因治疗后,BMP-2和IGF-1的表达水平与糖尿病组比较,有显著提高,差异具备统计学意义(P<0.05)。血中ALP水平得以明显改变,说明BMP-2和IGF-1的BMSCs的基因治疗有利于骨折的愈合。结论1糖尿病可导致骨密度下降,严重影响骨折后骨折部位骨痂的形成。2糖尿病大鼠骨折愈合过程中早期血清中BMP-2, IGF-1的减少,是引起骨折愈合差的因素之一。3在高糖环境下,BMP-2, IGF-1共转染BMSCs可正反馈促进BMP-2, IGF-1的表达。4BMP-2, IGF-1共转染BMSCs基因治疗后可明显改善糖尿病大鼠骨折愈合。