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目的:非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是从非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver,NAFL）到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）的一系列肝脏疾病,是超重及肥胖人群的常见慢性肝脏疾病,随着肥胖人群的增加,NAFLD的发病率及患病人数继续上升,在全球范围内,已成为最重要的肝病病因之一。NAFLD可随着疾病的进展,演变为肝硬化甚至肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,并成为肝硬化及HCC发病人数增长的主要原因。NAFLD相关的HCC因起病隐匿且缺乏有效的监测,发现时往往肿瘤分期较晚,且因患者心脏病及糖尿病等合并症较多,进行根治性治疗包括肿瘤切除尤其是肝移植的可能性减小。据报道,lncARSR参与体内的代谢进程,并在多种恶性肿瘤中水平增高,参与调控肿瘤的细胞学行为,包括增殖、迁移、侵袭及干细胞性,并与部分肿瘤的耐药性相关。本研究探讨lncARSR及其潜在靶基因Yes相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）对NAFLD疾病进程的影响及对NAFLD相关HCC细胞增殖及侵袭功能的影响,并探索上述过程中可能的调节机制。研究方法:1、对C57BL/6小鼠喂养高脂饮食来构建NAFLD动物模型,应用油酸培养Hep G2细胞模拟肝细胞高脂肪酸环境,取小鼠肝脏及细胞,进行脂质沉积,甘油三酯含量测定,并应用RT-q PCR方法检测lncARSR的表达水平。2、通过RNA pull-down实验分析lncARSR和YAP1的结合,并进行了RIP分析进一步验证二者的靶向结合关系,应用RNA FISH实验检测lncARSR和YAP1的亚细胞定位,应用Wsetern Blot检测YAP1和磷酸化YAP1在NAFLD小鼠肝脏组织中的表达水平。为了检测lncARSR对YAP1核转位的影响,应用Western Blot分别对油酸培养Hep G2细胞的胞核及胞质中YAP1和磷酸化YAP1的表达水平进行检测。3、为了进一步研究lncARSR对YAP1磷酸化和核转位的影响,对Hep G2细胞进行lncARSR过表达及沉默的慢病毒转染,应用RT-q PCR方法检测lncARSR的转染效率,转染后各组细胞中的YAP1及磷酸化YAP1表达水平应用Western Blot检测,各组细胞中的YAP1的亚细胞定位通过FISH检测。4、在NAFLD小鼠肝脏和油酸培养的Hep G2细胞中,通过RT-q PCR及WB检测IRS2的m RNA及蛋白表达水平,并应用WB检测AKT蛋白的表达,进一步探讨IRS2/AKT在NAFLD中的作用。并通过对Hep G2细胞进行lncARSR转染及lncARSR与YAP1的共转染,通过RT-q PCR及WB检测IRS2的m RNA及蛋白表达水平,并应用WB检测磷酸化YAP1及AKT蛋白的表达水平,进一步验证lncARSR通过YAP1对IRS2/AKT通路进行调节。5、向高脂饮食小鼠尾静脉注射sh-lncARSR慢病毒,取小鼠肝脏组织,通过RT-q PCR检测lncARSR的表达,HE染色及油红-O染色检测脂质沉积的改变,并检测甘油三酯含量的变化情况。应用RT-q PCR及WB检测IRS2的m RNA及蛋白表达水平,并应用WB检测磷酸化YAP1及AKT蛋白及脂肪生成相关蛋白（Fasn、Scd1和GPA）的表达水平。6、对油酸培养的Hep G2细胞进行lncARSR的过表达或沉默后,通过各组细胞的尼罗红染色检测脂质沉积的改变,并检测甘油三酯含量的变化情况;应用WB检测IRS2、磷酸化YAP1及AKT蛋白及脂肪生成相关蛋白（Fasn、Scd1和GPA）的表达水平,进一步研究lncARSR对NAFLD相关HCC中脂质沉积的影响。7、对转染lncARSR后的各组油酸培养Hep G2细胞,细胞增殖应用MTT法和软琼脂集落法检测,对于细胞周期的分析应用流式细胞术,细胞侵袭情况应用Transwell小室检测。8、通过向NAFLD小鼠皮下注射转染sh-lncARSR的Hep G2细胞进行体内皮下成瘤实验进一步研究lncARSR在NAFLD相关HCC中肿瘤生长的作用。结果:1、NAFLD小鼠肝脏及应用油酸培养Hep G2细胞的脂肪沉积显著高于对照组,甘油三酯的含量也显著增高（P<0.05）。lncARSR在NAFLD小鼠肝脏及中油酸培养Hep G2细胞中表达均显著增高（P<0.05）。2、RNA pull-down实验显示全长lncARSR探针下拉YAP1,RIP分析表明lncARSR和YAP1相互结合,YAP1为lncARSR的靶蛋白;FISH实验检测结果表明lncARSR和YAP1共定位于细胞质中;在NAFLD组小鼠肝脏组织中,磷酸化YAP1水平显著低于对照组（P<0.05）;在经油酸培养Hep G2细胞的细胞质中,磷酸化YAP1水平显著降低（P<0.05）,提示lncARSR与YAP1特异性的相互作用,促进YAP1的核转位。3、RT-q PCR表明,oe-lncARSR组lncARSR水平增高,sh-lncARSR组lncARSR水平降低（P<0.05）;Western blot结果显示磷酸化YAP1在oe-lncARSR组表达降低,而sh-lncARSR组表达增高（P<0.05）;FISH结果表明,YAP1在oe-lncARSR组细胞质中表达降低,细胞核中表达增高,sh-lncARSR组表现则相反。表明lncARSR调节抑制YAP1的磷酸化并促进YAP1的核转位。4、NAFLD组小鼠肝脏组织及油酸培养的Hep G2细胞中,IRS2的m RNA、蛋白表达水平及AKT的磷酸化水平均较对照组显著增高（P<0.05）。Hep G2细胞转染后RT-q PCR及WB结果表明,在oe-lncARSR组,IRS表达和磷酸化AKT的水平均增高,而YAP1的磷酸化水平降低;oe-lncARSR+sh-YAP1组,IRS表达、磷酸化AKT及YAP1水平均降低;sh-lncARSR组,IRS及磷酸化AKT水平下降,磷酸化YAP1水平增加,共转染YAP1S127D后作用增强;sh-lncARSR+oe-YAP1组,IRS及磷酸化AKT和YAP1均增加（P<0.05）。由此得出,lncARSR促进YAP1的核转位,激活IRS2/AKT通路。5、RT-q PCR表明,注射sh-lncARSR慢病毒后NAFLD小鼠肝脏的lncARSR表达显著低于对照组（P<0.05）,且小鼠肝脏的脂质沉积及甘油三酯含量显著下降（P<0.05）;NAFLD小鼠中,沉默lncARSR显著降低了IRS2的表达水平,增高了磷酸化YAP1水平,显著降低了磷酸化AKT的水平（P<0.05）;脂肪生成相关蛋白（Fasn、Scd1和GPA）表达水平均显著降低（P<0.05）。表明lncARSR沉默可以通过IRS2/AKT通路抑制NAFLD小鼠肝脏的脂肪沉积。6、油酸培养的Hep G2细胞中,oe-lncARSR组的脂质沉积及甘油三酯含量显著增高,而sh-lncARSR组显著下降（P<0.05）;WB结果表明,oe-lncARSR组,磷酸化YAP1显著降低、IRS2表达显著增加,磷酸化AKT水平显著增加,不影响总AKT的表达水平,而在sh-lncARSR组中变化相反（P<0.05）;脂肪生成相关蛋白（Fasn、Scd1和GPA）和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）的表达在oe-lncARSR组显著增高（P<0.05）,与细胞中的甘油三酯水平变化一致。由此得出,lncARSR促进NAFLD相关HCC细胞内的脂质沉积。7、oe-lncARSR组显著增加高脂肪酸培养的Hep G2细胞的增殖,而sh-lncARSR组显著降低（P<0.05）;流式细胞分析表明,oe-lncARSR组油酸培养Hep G2细胞停留在S期的数量明显增高（P<0.05）;Transwell侵袭实验表明,oe-lncARSR组的细胞侵袭性显著增强,而sh-lncARSR组减低（P<0.05）。因此得出,lncARSR促进NAFLD相关HCC的细胞增殖及侵袭。8、sh-lncARSR转染Hep G2细胞组NAFLD小鼠肿瘤的体积及重量显著低于对照组（P<0.05）,提示lncARSR可抑制NAFLD相关HCC的肿瘤生长。结论:1、lncARSR通过靶向调节YAP1,增强IRS2/AKT的活性以促进NAFLD的疾病进展。2、lncARSR可通过抑制YAP1磷酸化,增强IRS2/AKT的活性促进NAFLD相关HCC细胞的增殖、侵袭及肿瘤生长。