日粮纤维是改善母猪肠道健康和繁殖性能的重要营养素。课题组前期研究表明,母猪妊娠期一个或两个繁殖周期采用纤维处理,可改善母猪繁殖成绩。但仍有研究发现,妊娠期添加纤维对母猪繁殖性能无显著影响。造成结果不一致的原因可能有以下3点:(1)纤维添加水平。饲粮中纤维添加量过高会降低饲粮的养分消化率,添加过低则效果不显著,因此妊娠期纤维添加水平对母猪繁殖性能的影响还需要进一步研究。(2)纤维添加时间。研究证实,妊娠期添加纤维,连续处理两胎及以上,可显著改善母猪繁殖性能,如提高产仔数和初生窝重,但是连续多胎妊娠期添加纤维改善母猪繁殖性能的机理目前尚不清楚。(3)纤维添加类型。不同纤维原料的不可溶性纤维(ISF)和可溶性纤维(SF)的含量不同,导致饲粮中的ISF/SF比例存在巨大的差异。研究表明,饲粮中的ISF/SF比例可影响养分的消化利用率,这可能是纤维影响母猪繁殖性能的重要因素之一。然而,妊娠期ISF/SF比例对母猪繁殖性能的影响目前报道较少。纤维水平和类型均会影响肠道菌群的组成和多样性,而妊娠期添加纤维改善母猪繁殖性能机理是否与微生物有关,需要进行探究。因此,本论文旨在考察妊娠期添加纤维及ISF/SF比例对母猪连续多胎繁殖性能的影响,并从肠道菌群角度探讨纤维营养改善母猪繁殖性能的可能途径。本论文主要研究内容及结果如下:试验一妊娠期日粮添加纤维对母猪连续三胎繁殖性能和粪便菌群的影响试验选取体重(132.34±1.22 kg)、背膘(14.33±0.48 mm)和日龄(232±1 d)相近的新加系LY后备母猪36头。配种后随机分为低纤维组(LF)和高纤维组(HF),每个处理18个重复,每个重复1头母猪。LF组日粮为典型的玉米-豆粕型饲粮,HF组日粮是在LF组日粮中额外添加22.60 g/kg菊粉和181.60 g/kg纤维素进行配制,并保证两个处理日粮中ISF/SF比例一致(ISF/SF=8.03)。试验进行连续的三个繁殖周期,LF组母猪前三胎妊娠1-89天平均每天摄入224.96 g膳食纤维(DF)、妊娠90-112天平均每天摄入265.80 g DF;HF组母猪前三胎妊娠1-89天平均每天摄入674.89 g DF、90-112天平均每天摄入797.40 g DF。同时,所有母猪在泌乳期饲喂同一泌乳饲粮。各胎次配种当天、妊娠110天、分娩当天和断奶当天对所有母猪进行称重并测定背膘厚,记录母猪连续三个胎次的产仔性能、哺乳性能和泌乳期采食量。记录第一胎分娩前后5天以及第二、三胎妊娠30、60、90和110天粪便形态并评分。第一胎妊娠30、60、90、110天和断奶当天以及第二胎妊娠30、60、90和110天采集母猪粪便样品,用于16S r DNA的测定。试验主要结果如下:(1)与LF组相比,HF组显著提高第二胎和第三胎总初生窝重和活产窝重(P<0.05)以及前三胎平均总初生窝重和活产窝重(P<0.05);缩短第一胎分娩时长47min(P<0.05);显著提高第二胎和第三胎的胎盘重(P<0.05);第三胎活产仔数提高1.8头(P<0.1),前三胎平均活产仔数提高1.24头(P<0.05);(2)HF组显著提高第一胎母猪泌乳0-14天采食量、仔猪断奶个体重和泌乳0-28天仔猪体增重(P<0.05);显著增加第二胎仔猪断奶个体重和泌乳0-28天仔猪体增重(P<0.05);(3)HF组显著提高母猪第二胎妊娠30、60、90和110天粪样菌群的observed＿species指数和chao 1指数(P<0.05),显著改变第一胎和第二胎妊娠期的粪样菌群β多样性(P<0.05),且有改变第一胎断奶当天粪便菌群β多样性的趋势(P<0.10);(4)HF组显著降低母猪第二胎妊娠30天粪便Tenericutes和Actinobacteria菌门以及Clostridium＿sensu＿stricto＿1、Streptococcus和Ruminococcus＿1菌属的丰度(P<0.05),显著提高Fibrobacteres菌门以及Lactobacillus、Christensenellaceae＿R-7＿group、[Eubacterium]＿coprostanoligenes＿group和Lachnospiraceae＿AC2044＿group菌属的丰度(P<0.05),并且Tenericutes和Ruminococcus＿1与第二胎初生窝重呈显著的负相关(P<0.05),Lactobacillus、Christensenellaceae＿R-7＿group和[Eubacterium]＿coprostanolige nes＿group与第二胎初生窝重呈显著的正相关(P<0.05)。以上结果表明,(1)连续三胎妊娠期日粮添加纤维可提高母猪第一、二胎断奶窝重以及第二、三胎初生窝重,缩短分娩产程,改善母猪粪便评分;(2)妊娠期日粮添加纤维,处理至第二胎,可显著改变母猪妊娠期粪便菌群的种类和多样性;(3)妊娠期增加日粮纤维摄入量改善第二、三胎母猪初生窝重可能与提高了相应胎次妊娠30天Lactobacllius、Eubacterium和Lachnospiraceae等有益菌和纤维降解菌的丰度以及菌群多样性有关。试验二妊娠期日粮添加纤维对母猪粪便微生物组和血浆代谢物的影响试验一表明,母猪妊娠期日粮添加纤维提高仔猪初生窝重与肠道菌群的改变有关。本试验在试验一的基础上,利用宏基因组和代谢组学技术考察妊娠期日粮添加纤维对母猪粪便微生物组和血浆代谢物的影响,探究纤维调控母猪繁殖性能的微生物途径。试验设计同试验一。第二胎断奶母猪发情配种后,保持原处理不变,在第三胎妊娠30、60、90和110天,每个处理选取8头母猪空腹采血并收粪,用于相关指标分析,其中妊娠30天的母猪血样和粪便样品分别用于代谢组学和宏基因组学分析;母猪分娩当天,各处理选取6头正常分娩的母猪采集胎盘样品,考察胎盘相关基因的表达量。结果如下:(1)与LF组相比,HF组显著提高母猪第三胎妊娠30天粪样乙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸(VFAs)水平(P<0.05),有提高丙酸水平的趋势(P=0.076);显著提高妊娠60、90和110天粪样乙酸、丙酸、丁酸和总VFA水平(P<0.05);(2)HF组显著提高母猪第三胎妊娠30天和110天血清中血清素浓度以及胎盘血清素和孕酮浓度(P<0.05);显著上调胎盘血清素转运载体(SERT)、血清素受体(5-HT2B和5-HT7)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、细胞色素P450 scc(CYP11A1)、钠偶联中性氨基酸转运载体-2(Slc38a2)和葡萄糖转运载体-2(GLUT2)的m RNA表达量(P<0.05),下调色氨酸羟化酶-1(TPH1)和印迹基因H19的m RNA表达量(P<0.05);(3)在门水平上,HF组显著降低母猪粪便Firmicutes/Bacteroidetes比值(P<0.05),显著提高Bacteroidetes、Proteobacteria和Fibrobacteria的丰度(P<0.05);在属水平上,显著降低母猪粪便Clostridium和Tuicibacter的丰度(P<0.05),显著提高Prevotella、Oscillibacter、Eubacterium、Alistipes、Faecalibacterium和Fibrobacter的丰度(P<0.05);在种水平上,显著降低Clostridium sp.CAG:452和Clostridium sp.CAG:138的丰度(P<0.05),显著提高Firmicutes bacterium CGA:110、Firmicutes bacterium CGA:555、Prevotella sp.P2-180、Prevotella sp.CAG:279和Firmicutes bacterium CGA:129的丰度(P<0.05);(4)将HF组和LF组粪便微生物的差异基因与KEGG代谢通路第二层级进行对比,发现23种聚类系统存在显著差异(P<0.05);通过KEGG通路富集发现,具有显著差异且相对丰度在前35的通路(P<0.05)主要与营养物质的合成、代谢和转运相关;与碳水化合物活性酶数据库(CAZy)对比,发现与糖苷水解酶和糖苷转移酶的相关的基因丰度最高,且均在HF组富集(P<0.05);(5)通过代谢组学分析发现,HF组和LF组第三胎妊娠30天血浆共有39种差异代谢物。将这些差异代谢物与KEGG数据库进行对比后发现,色氨酸代谢通路,苯并恶唑嗪酮生物合成通路,以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路显著改变(P<0.05),其原因是妊娠期日粮添加纤维显著降低第三胎妊娠30天血浆吲哚的浓度(P<0.05);(6)将宏基因组学和代谢组学结果进行关联分析发现,Firmicutes bacterium CAG:110与吲哚的合成呈显著性负相关(P<0.05)。以上结果表明:(1)连续三胎在妊娠期日粮添加纤维可提高母猪第三胎妊娠30天粪便中纤维降解菌的丰度,促进VFAs的生成,降低粪便致病菌的丰度;(2)连续三胎在妊娠期日粮添加纤维可能通过提高母猪粪便中VFAs产生菌、Eubacterium和Firmicutes bacterium CAG:110的丰度,提高母猪和胎盘血清素的浓度,改善胎盘的发育和功能,进而提高母猪繁殖性能。试验三日粮纤维对妊娠母猪结肠和胎盘血清素水平的影响试验二发现,妊娠期日粮添加纤维显著提高了母体血清和胎盘血清素的水平。但是,妊娠日粮添加纤维是否会影响母猪结肠血清素的水平目前尚不清楚。试验选取体重和日龄相近的新加系LY后备母猪10头,配种后随机分为2个处理,即无纤维组(NF)和纤维组(F),每个处理5个重复,每头重复1头母猪。NF组采用纯合日粮,F组妊娠期日粮是通过在NF组妊娠期日粮中额外添加菊粉(8.33 g/kg)和纤维素(200g/kg)配制。母猪配种后处理至妊娠106天,采用Zoletile 50静脉麻醉后屠宰取样,记录每头母猪的胎儿数和胎儿重,并采集母猪血样以及结肠和胎盘组织样,考察妊娠期添加纤维对母猪结肠和胎盘血清素水平的影响。试验主要结果如下:(1)与NF组相比,F组显著提高胎儿总重(P<0.05),但不影响胎儿数(P>0.05);(2)F组显著提高母猪结肠食糜中乙酸、丙酸和总VFAs的浓度(P<0.05),显著提高母猪血清和结肠血清素的浓度以及结肠TPH1的浓度和表达量(P<0.05),显著降低结肠SERT的表达量(P<0.05);(3)F组显著提高胎盘血清素的浓度和SERT的表达量(P<0.05),显著降低胎盘TPH1的浓度和表达量(P<0.05)。以上结果表明:(1)纤维处理可促进妊娠母猪结肠TPH1的表达,提高结肠和血清中血清素的水平;无纤处理可促进结肠SERT的表达。(2)纤维处理可促进妊娠母猪胎盘SERT的表达,提高胎盘血清素的水平;而无纤处理可促进胎盘TPH1的表达。试验四妊娠期日粮纤维比例对母猪连续四胎繁殖性能和粪便菌群的影响前三个试验结果表明,在妊娠饲粮ISF/SF比例一致的条件下,提高妊娠母猪纤维摄入量,可通过影响肠道菌群提高母猪的繁殖成绩。但是妊娠期ISF/SF比例对母猪繁殖性能的影响以及妊娠饲粮中适宜的ISF/SF目前尚不清楚,并且妊娠期ISF/SF比例能否通过改变肠道菌群影响母猪繁殖性能目前也尚未有研究报道。本试验选取体重(153.23±1.02 kg)、背膘(15.76±0.34 mm)和日龄(284±1 d)相近的新加系LY后备母猪64头,配种后随机分为4个处理,每个处理16个重复,每个重复1头母猪,妊娠期分别饲喂不同ISF/SF比例的饲粮(T1:3.89、T2:5.59、T3:9.12、T4:12.81),母猪在泌乳期饲喂同一泌乳饲粮,系统考察妊娠期ISF/SF比例对母猪繁殖性能和粪便菌群的影响。试验持续四个连续的繁殖周期。各胎次配种当天、妊娠110天、分娩当天和断奶当天对所有母猪进行称重并测定背膘厚,记录母猪连续四个胎次的产仔性能、哺乳性能和泌乳期采食量。记录第一胎分娩前后5天以及第二、三胎妊娠30、60、90和110天粪便形态并评分。第一、二胎妊娠30、60、90、110天采集母猪粪便样品,用于16S r DNA的测定。采集第三胎妊娠30、60、90和110天血液样品以及分娩当天胎盘样品,用于相关指标的测定。试验主要结果如下:(1)ISF/SF比例对母猪第一至四胎每一胎的产仔数和初生窝重无显著影响(P>0.05),但T1和T2组的前四胎平均总产仔数、活产仔数和总初生窝重显著高于T3组(P<0.05),且T2组的平均活产仔数最高;(2)ISF/SF比例对各胎次母猪泌乳期采食量无显著影响(P>0.05),但日粮纤维比例显著影响第一胎哺乳仔猪的生长性能;第一胎时T1组和T2组仔猪断奶重显著高于T4组(P<0.05);(3)ISF/SF比例对第一胎母猪分娩产程无显著影响(P>0.05),但第二胎时T1和T2组的仔猪出生间隔分别比T3组缩短5.25 min和6.44 min(P<0.05),第三胎时T1和T2组的分娩时长分别比T3组缩短98.76 min和97.40 min(P<0.05);(4)第一胎时,T1组母猪妊娠110天粪便乙酸浓度显著高于T3和T4组,T1组总VFAs浓度显著高于T4组(P<0.05);第二胎时,T2组母猪妊娠110天乙酸和总VFAs浓度显著高于T3和T4组(P<0.05);第三胎时,T2组母猪粪样乙酸含量最高且显著高于T4组(P<0.05),T2组母猪血清中血清素浓度显著高于其他各组(P<0.05),然而日粮纤维比例对胎盘血清素含量和孕酮浓度无显著影响(P>0.05);(5)当ISF/SF=3.89时,初产母猪粪便中纤维降解菌Prevotella的丰度升高(P<0.05);当ISF/SF=5.59时,第二胎母猪粪便中致病菌Streptococcus的丰度降低,有益菌Bifidobacterium和纤维降解菌Prevotella的丰度升高(P<0.05);(6)ISF/SF比例对第一胎和第二胎母猪妊娠30天肠道菌群α多样性影响无显著影响(P>0.05);第一胎妊娠110天时,T1、T2和T3组的chao 1指数显著高于T4组(P<0.05);第二胎妊娠110天时,T4组母猪肠道微生物observed species指数、shannon指数显著高于T1组(P<0.05),T1组的chao 1指数有低于T3和T4组的趋势(P<0.10);与第一胎相比,第二胎妊娠110天Ruminococcaceae、Spirochaetaceae、Bacteroidales＿S24＿7、Lachnospiraceae和Rikenellaceae的相对丰度显著升高(P<0.05),Prevotellaceae、Lactobacillaceae、Streptococcaceae和Clostridiaceae＿1的丰度显著降低(P<0.05);(7)通过肠道微生物的β多样性分析,第一、二胎妊娠110天T1和T2组母猪肠道微生物菌落结构趋于一致,T3和T4组的菌落结构趋向一致,而T1和T2组与T3和T4组的群落结构具有明显的差异(P<0.05)。以上结果表明,(1)在本试验条件下,当ISF/SF=3.89和5.59时,可提高第一胎仔猪的断奶重,并缩短第二胎和第三胎分娩产程,提高母猪第一至四胎平均总产仔数、活产仔数和总初生窝重;(2)在本试验条件下,对于初产母猪,当饲粮中ISF/SF=3.89时,有利于纤维降解菌的增殖和VFAs的生成;对于经产母猪,当饲粮中ISF/SF=5.59时,有利于纤维降解菌的增殖和VFAs的生成。这可能与初产母猪和经产母猪肠道菌群的组成和多样性的差异有关。(3)在本试验条件下,当饲粮中ISF/SF=5.59时,更有利于有益菌Bifidobacterium的增殖。试验五母猪妊娠期日粮纤维比例对新生仔猪肠道发育、抗氧化能力和肠道菌群的影响试验四发现,当妊娠期饲粮ISF/SF=3.89和5.59时可显著改善仔猪生长性能,但是其原因尚不清楚。前人研究结果发现,母猪纤维营养可影响后代仔猪的肠道发育和菌群组成,因此,母猪妊娠期饲粮中适宜ISF/SF比例改善仔猪生长性能可能与促进仔猪肠道发育和改变肠道菌群有关。为了验证该假设,于第一胎分娩当天,从试验四T1、T2、T3和T4四个处理中分别选择6头产仔数正常、乳腺发育良好且健康的母猪,每窝选择一头接近该窝平均体重的仔猪于出生后2h内、吃到初乳前,采用Zoletile50肌肉注射麻醉后进行屠宰。各处理对应的后代仔猪编号分别为R1、R2、R3和R4。仔猪屠宰前称重并采集血样,测定血液免疫和抗氧化相关指标;仔猪屠宰后,采集肝脏和肠道样品用于指标的测定。结果如下:(1)R3组新生仔猪十二指肠绒隐比(V/C)显著高于R4组(P<0.05),R1和R2组仔猪空肠V/C显著高于R3和R4组(P<0.05);新生仔猪R1组乳糖酶活性显著高于R3和R4组,且R2组显著高于R4组(P<0.05);R4组蔗糖酶活性显著低于其它三组(P=0.021);(2)R1组新生仔猪血浆肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平显著低于R3和R4组,且R2组显著低于R3组(P<0.05);R1和R2组新生仔猪血浆总抗氧化能力(T-AOC)显著高于R4组(P<0.05),R1组和R2组血浆谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著高于R3和R4组(P<0.05);R1和R2组新生仔猪肝脏过氧化氢酶(CAT)活性显著高于R4组(P<0.05);R1组仔猪肝脏GSH-Px活性显著高于R3和R4组,且R2组显著高于R3组(P<0.05);(3)R1组仔猪肝脏Nrf2 m RNA表达量显著高于R3和R4组(P<0.05),且R2组显著高于R4组(P<0.05);R1和R2组仔猪肝脏HO-1 m RNA表达量显著高于R4组(P<0.05);R1和R2组仔猪肝脏NF-κB m RNA表达量显著低于R3和R4组(P<0.05);(4)R1和R2组新生仔猪结肠乙酸、丁酸和总SCFAs的浓度显著高于R3和R4组(P<0.05),并且R1和R2组仔猪结肠丙酸的浓度有高于R3和R4组的趋势(P<0.10);(5)PCo A聚类分析表明,R1和R2具有相似的微生物菌群组成,而R3和R4具有相似的微生物组成。R1和R2组仔猪结肠中与纤维降解相关的微生物菌群丰度提高。另外R1和R2组仔猪结肠unidentified＿Enterobacteriaceae相对丰度显著低于R4组(P<0.05)。以上结果表明,在本试验条件下,当母猪妊娠期饲粮中ISF/SF=3.89和5.59时,可提高后代新生仔猪抗氧化能力并降低炎症反应,最终促进其后代的肠道发育,这可能与新生仔猪结肠有益菌的相对丰度提高、有害菌相对丰度降低有关。综上所述,本论文得到以下结论:(1)在本试验条件下,母猪前三胎妊娠1-89天平均每天摄入674.89 g DF、90-112天平均每天摄入797.40 g DF(ISF/SF=8.03),可提高母猪第二胎和第三胎的初生窝重,这主要与增加纤维摄入量提高了妊娠母猪肠道纤维降解菌、Eubacterium和Firmicute bacteria CGA:110的丰度,促进结肠血清素的合成,提高母猪和胎盘血清素的水平,最终改善了胎盘的发育和功能有关。(2)在本试验条件下,当饲粮中ISF/SF=3.89和5.59时,可促进第一胎哺乳仔猪的生长发育,并提高母猪前四胎的平均产仔数和初生窝重。对于初产母猪,可调整妊娠饲粮中ISF/SF比例为3.89;对于第二至四胎母猪,可调整妊娠饲粮中ISF/SF比例为5.59。(3)母猪妊娠期日粮纤维比例可影响后代新生仔猪肠道菌群的组成,且新生仔猪的肠道菌群群落相似性和母猪的肠道菌群群落相似性一致。