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目的:在ER阳性乳腺癌细胞中,研究BAG-1对4-羟基-他莫昔芬治疗敏感性的影响,并探讨BAG-1基因和AKT,p-AKT,m-TOR,p-mTOR的关系;研究BAG-1不同表达水平的ER阳性乳腺癌细胞对mTOR抑制剂的治疗反应性;并探索了mTOR抑制剂联合4-羟基-他莫昔芬对BAG-1不同表达水平的ER阳性乳腺癌治疗效果,为乳腺癌内分泌治疗耐药人群的筛选及疗效的预测提供新的分子指标。方法:1.培养ER阳性乳腺癌细胞株T47D,首先采用Western Blot验证T47D细胞株的分子表型;构建质粒,使用脂质体转染技术改变ER阳性乳腺癌细胞株T47D的BAG-1表达水平,并通过Real-time PCR和Western Blot检测转染效率(T47DBAG-1hi、T47Dcon和T47DBAG-1-)2.确定4-羟基-他莫昔芬的半数致死量(IC50)所对应的浓度;使用IC50的4-羟基-他莫昔芬(10uM)分别处理T47DBAG-1hi、T47Dcon和T47DBAG-1-,48h后通过AnnexinV-APC-7AAD双染色法检测细胞凋亡情况、流式细胞术测细胞周期以观察BAG-1不同表达水平的ER阳性乳腺癌细胞对4-羟基-他莫昔芬的敏感性差异。3.使用Western Blot方法检测BAG-1不同表达水平的ER阳性乳腺癌细胞中AKT/mTOR的表达水平,观察其与BAG-1的关系。4.确定mTOR抑制剂雷帕霉素的IC50;使用IC50的mTOR抑制剂雷帕霉素(10uM)分别处理T47DBAG-1hi、T47Dcon和T47DBAG-1-,48h后通过AnnexinV-APC-7AAD双染色法检测细胞凋亡情况、流式细胞术测细胞周期以观察BAG-1不同表达水平的ER阳性乳腺癌细胞对雷帕霉素的敏感性差异。5.使用IC50的mTOR抑制剂雷帕霉素(10uM)联合4-羟基-他莫昔芬(10uM)分别处理T47DBAG-1hi、T47Dcon和T47DBAG-1-,48h后通过AnnexinV-APC-7AAD双染色法检测细胞凋亡情况、流式细胞术测细胞周期以观察BAG-1不同表达水平的ER阳性乳腺癌细胞对内分泌治疗联合mTOR抑制剂的敏感性差异。结果:1.乳腺癌细胞株T47D与MDA-MB-231及SK-BR-3乳腺癌细胞株相比ER高表达,HER-2不表达。Real-time PCR和Western Blot验证转染了BAG-1 p50质粒的T47D细胞BAG-1 p50的表达水平较空质粒转染组升高(P<0.05),转染了shRNA的T47D细胞BAG-1的表达水平降低(P<0.05)。2.使用IC50的4-羟基-他莫昔芬(10uM)分别处理48h后,T47DBAG-1hi与T47Dcon相比对4-羟基-他莫昔芬的敏感性升高((65.10±2.35)%vs.(55.03±2.39)%,P=0.039),处于G0/G1期细胞比例上升((66.72±2.63)%vs.(62.15±2.46)%,P=0.093),同时,T47DBAG-1-对4-羟基-他莫昔芬的敏感性降低((41.70±1.93)%vs.(55.03±2.39)%,P=0.012),处于G0/G1期细胞比例下降((51.27±2.67)%vs.(62.15±2.46)%,P=0.007)。3.Western Blot检测到T47DBAG-1hi和T47DBAG-1-中AKT表达水平与T47Dcon相比无明显变化,但在T47DBAG-1hi中p-AKT、mTOR、p-mTOR表达水平与T47Dcon相比明显降低,T47DBAG-1-中p-AKT、mTOR、p-mTOR表达水平与T47Dcon相比升高。4.使用IC50的mTOR抑制剂雷帕霉素(10uM)分别处理48h后,T47DBAG-1hi与T47Dcon相比,细胞凋亡率降低((50.70±0.59)%vs.(57.07±2.46)%,P=0.065),处于G0/G1期的细胞百分比下降((53.15±1.63)%vs.(58.23±1.32)%,P=0.014);T47DBAG-1-与T47Dcon相比,细胞凋亡率增高((66.87±2.27)%vs.(57.07±2.46)%,P=0.043);处于G0/G1期的细胞百分比上升((65.99±1.49)%vs.(58.23±1.32)%,P=0.002)。5.4-羟基-他莫昔芬联合mTOR抑制剂雷帕霉素同时处理T47DBAG-1hi、T47Dcon和T47DBAG-1-,T47DBAG-1hi与T47Dcon相比,细胞凋亡率增高((66.93±1.27)%vs.(58.8±1.89)%,P=0.024),处于G0/G1期的细胞百分比上升((67.28±3.70)%vs.(63.02±3.80)%,P=0.347);T47DBAG-1-与T47Dcon相比,细胞凋亡率增高((71.23±2.23)%vs.(58.8±1.89)%,P=0.013),处于G0/G1期的细胞百分比上升((70.53±2.30)%vs.(63.02±3.80)%,P=0.043);发现三者的细胞凋亡率及处于G0/G1期的细胞比例均有所增加,且以T47Dcon为基准,T47DBAG-1-的细胞凋亡率上升较T47DBAG-1hi明显((12.43±0.82)%vs.(8.13±0.83)%,P=0.021),处于G0/G1期的细胞比例增高明显((4.25±5.70)%vs.(7.51±1.85)%,P=0.044)。结论:在ER阳性乳腺癌细胞T47D中,BAG-1的表达水平会影响4-羟基-他莫昔芬的治疗敏感性,BAG-1或许可以成为一项预测他莫昔芬治疗敏感性的分子指标,对于低表达BAG-1 ER阳性易可能出现4-羟基-他莫昔芬耐药的乳腺癌患者联合使用mTOR抑制剂或许更能加强对疾病的控制,提高治疗效果及延长患者无病生存期和总生存期。