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目的:在体外扩增培养的过程中，探讨不同传代次数的人脐带间质干细胞（humanumbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）生物学特征的改变及建立过氧化氢(H2O2)诱导的人脐带间质干细胞早衰模型，进而探索氧化应激与脐带间质干细胞衰老的可能关联，从而为临床选用优质干细胞治疗提供相应参考依据。 方法:(1)分离培养hUC-MSCs，采用组织块贴壁法。借助于形态特征、表面抗原标记等对其进行生物学特性鉴定。(2)原代培养细胞作为P0代hUC-MSCs，分别选取第4代(P4)，第11代(P11)，第17代(P17)分别代表年轻组，中年组及老年组。比较脐带间质干细胞在体外传代扩增的过程中，这三个阶段干细胞生物学性状上的差异。扫描电镜观察细胞膜表面超微结构及免疫荧光法检测细胞核染色质变化;MTT方法用于检测细胞增殖活力;采用衰老相关β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)，检测不同代数hUC-MSCs衰老的变化;茜素红染色检测不同代数hUC-MSCs成骨分化，油红O细胞化学染色检测其成脂分化能力;流式细胞仪分析检测细胞周期及检测细胞内ROS表达量水平;免疫荧光法验证ROS在细胞内的定位;通过收集条件培养基，我们采用transwell迁移实验检测不同代数细胞分泌细胞因子的差异，从而间接反映不同传代能力hUC-MSCs分泌细胞因子的差异。RT-PCR技术检测衰老基因p53，p21及氧化还原因子APE1/Ref-1表达情况。(3)为探讨衰老与氧化应激的关系，我们选用不同浓度的氧化剂H2O2处理年轻组P4代hUC-MSCs，检测β-半乳糖苷酶活性，细胞周期及相应基因p53，p21及APE1/Ref-1情况。(4)采用GraphPad Prism5.0软件进行数据统计分析，当p＜0.05时，认为差异有统计学意义。 结果:(1)从脐带组织中分离出一种长梭形细胞，经纯化后流式细胞仪鉴定符合间质干细胞相应表面标志:CD29(+)，CD44(+)，CD90(+)，CD105(+)，CD34(-)及HLA-DR(-).(2)不同代数的hUC-MSCs，其细胞形态的改变。扫描电镜显示，年轻组P4代细胞呈典型的瘦长，梭型，形态饱满立体，表面微绒毛分布均匀，而中年组P11代及老年组P17代，细胞形态复杂多变，宽大扁平，表面微绒毛分布稀少不均，并且细胞伪足增多，增多的伪足数目不一。此种变化在P17代表现尤其明显。DAPI染核显示，在年轻组细胞核中DNA呈均一分布，而老年组细胞核则呈现十分明显的DNA点块状聚集，即衰老相关异染色质聚集(senescence-associated heterochromatic foci，SAHF)。中年组细胞核DNA染色质相对均一，虽未达到点状聚集状态，但有开始聚集趋向，可能处在一种过渡衰老状态。衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色显示，年轻组，中年组，老年组阳性率分别为:1.15％，35.3％，65.8％，说明衰老细胞在体外扩增的过程中逐渐增多，。(3) MTT检测结果显示，增殖能力随着传代次数的增加而下降，老年组hUC-MSCs增值能力明显降低，生长曲线趋向于停滞。流式细胞周期显示，P4，P11及P17代细胞G1期含量分别是:59.88％，63.85％，87.66％，可见老年组细胞发生明显的G1期阻滞。此外，transwell迁移实验显示，不同代数的hUC-MSCs分泌的细胞因子的能力发生显著改变。这个结果暗示我们，体外长期培养的过程中，干细胞的微环境很可能已经发生改变。(4)分化能力:成脂诱导21天后，油红O染色显示，与年轻组相比，中年组及老年组细胞诱导分化成脂肪滴能力均降低。成骨诱导14天，茜素红染色显示，与年轻组相比，中年组及老年组细胞诱导分化能力均降低，而老年组降低更显著。但在老年组成骨诱导分化的过程中，出现一个特殊的细胞集落，与周围宽大扁平的衰老细胞相比，这群细胞形态明显的小，规则，类圆形，似上皮样改变。由于在微环境发生变化的条件下，衰老细胞更容易发生癌变，所以我们高度怀疑这个集落是在成骨微环境条件下形成的肿瘤突变株，虽然我们尚未对其进行详细证明。(5)细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS):流式分析显示，与P4代细胞相比，P11及P17代细胞内ROS水平曲线右移，平均荧光强度逐渐增高。免疫荧光与流式显示结果一致，二者均可说明，细胞内的活性氧在体外培养扩增的过程中是不断累聚的。(6)基因表达:RT-PCR显示，与年轻组P4代细胞相比,p53，p21和APE1/Ref-1 mRNA表达量在P11，P17代中表达上调，但中年组P11代各基因表达量要略强于老年组P17代。(7)早衰模型:β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色、流式细胞周期及基因表达显示，随着H2O2作用浓度的增加，衰老细胞在脐带间质干细胞中比例增加，细胞阻滞在G1期增多，衰老相关基因p53，p21表达不同程度增高，氧化还原因子APEI/Ref-1基因表达上调。建立脐带间质干细胞早衰模型的最佳H2O2浓度为600μM。 结论:(1)体外长期扩增培养，可导致脐带间质干细胞发生衰老，从而影响其增殖分化潜能，因此临床应用干细胞时，应严格把握干细胞的质量，评估其生物安全性。(2)H2O2可诱导脐带间质干细胞发生衰老，而建立脐带间质干细胞早衰模型的最佳H2O2浓度为600μM。