背景骨质疏松症(osteoporosis, OP)为骨的全身性代谢疾病之一,其中常见的原发性骨质疏松症(不伴随引起骨质疏松的其他功能紊乱状态或疾病),包括绝经后骨质疏松症(PMOP, I型)和老年性骨质疏松症(senile OP, II型)。随老龄化社会的发展,骨质疏松症患者急剧增多,如何有效预防和治疗骨质疏松已经成为国内外的热门话题。骨质疏松症的概念已经提出百余年,经过不断的研究,并随着科学技术的发展,学者对骨质疏松症发病机制的细胞水平和分子水平理解不断更新,对其认识日臻完善,启发人们从细胞、分子水平甚至基因水平去对骨质疏松症进行治疗。骨质疏松症主要是单位体积内骨量减少和骨微结构破坏(以骨矿成分和骨基质等比例不断减少、骨小梁减少和紊乱、骨质变薄、骨皮质多孔和变薄等为特征),从而导致其强度降低、脆性增加、同时易骨折的代谢性、全身性疾病。临床上对骨质疏松症的治疗目前以药物为主,作用机理主要是抑制骨吸收,阻止骨丢失,促进骨形成,从而纠正骨转换的异常,进而改善骨质量,降低骨折等并发症的发生。虽然长期用药可以在很大程度上改善症状,但治疗周期漫长,不能达到根治的目的,费用不低且存在着一定的不良反应。因此,新的治疗方法的研究一直方兴未艾,而骨质疏松症的发病机制可理解为未分化的干细胞向成骨细胞分化的能力低下,导致在骨组织吸收后的骨重建、形成不足。由此,治疗骨质疏松的关键或许是如何有效地补充成骨细胞,来抑制破骨细胞的骨吸收,从而重建骨代谢的平衡。脂肪组织中分离获取的脂肪源干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是间充质干细胞的一种。随着再生医学的发展,脂肪源干细胞的研究逐渐成为干细胞研究的热点。相比骨髓间充质干细胞,ADSCs来源更广泛,获取更容易,给病人带来的创伤和痛苦更小。脂肪源干细胞容易分离培养；能跨胚层分化,具有多向诱导分化潜能,在特定的环境下可向成骨、成软骨、成脂、成生殖、成肌和成神经等方向分化；具有低免疫原性、免疫抑制和免疫调节功能。脂肪源干细胞的这些特性为移植提供了更有利条件。通过增加机体内未分化的ADSCs,促进成骨分化,从而加强骨重建,可能会在骨质疏松的治疗领域起到相应的作用。为了探讨异体脂肪源干细胞移植对老年性骨质疏松的预防和治疗作用,本实验通过微型计算机断层成像(micro CT)、血清学等检测方法来观测脂肪源干细胞移植对自发老年性骨质疏松模型小鼠(仅有的一种能证明增龄性骨脆性骨折的实验动物SAMP6)体内自由基、血清睾酮、骨钙素、钙、磷、碱性磷酸酶等代谢,以及骨密度、骨生物力学、骨组织形态计量学等方面的影响,从而综合评价这一治疗骨质疏松的手段,为研究骨质疏松症探索新的思路。目的1、体外分离培养取自SD大鼠腹股沟皮下垫的ADSCs,并对其进行多向分化潜能和表面标志的鉴定；2、观测脂肪源干细胞移植对自发老化性骨质疏松小鼠SAMP6的血清睾酮(T)、骨钙素(BGP)、血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)等表达的影响,阐述脂肪源干细胞移植抗代谢性衰老的血清学意义；3、通过检测小鼠血清钙、磷、碱性磷酸酶,观测ADSCs移植对自发老化性骨质疏松小鼠SAMP6体内的钙磷代谢及骨形成的影响；4、通过micro CT检测实验小鼠的骨密度和骨微结构,观测ADSCs移植对自发老化性骨质疏松小鼠SAMP6骨质量和骨组织微环境的影响；5、通过三点弯曲试验检测,观察移植ADSCs对自发老化性骨质疏松小鼠SAMP6骨强度及骨刚度的影响；6、通过骨组织形态计量学观测,评估移植ADSCs对自发老化性骨质疏松小鼠SAMP6骨内微环境的影响；7、为干细胞可以治疗代谢性、退行性和衰老性疾病提供部分实验依据。方法1、于2月龄SD大鼠腹股沟皮下脂肪垫取材,以酶消化法来体外分离培养脂肪源干细胞。对5代脂肪源干细胞采用形态学及流式细胞术鉴定(表面抗原CD29、CD90、CD11b、CD49d、CD106和CD45)。第5代ADSCs通过采用定量PCR观察ADSCs在维甲酸诱导下是否能表达生殖细胞相关基因Oct4、Dazl、 Nobox、Piwil,进而判断ADSCs是否具有向生殖细胞分化的潜能；并分别经成骨诱导分化和成脂肪诱导分化后,进行相应的茜素红和油红O染色,进而判断所培养的细胞是否为具有多向分化潜能的脂肪源干细胞。2、20只6月龄雄性自发老化性骨质疏松小鼠SAMP6、10只6月龄正常同源对照小鼠SAMR1,随机分为SAMR1空白对照组(A组)、SAMP6骨质疏松模型对照组(B组)、ADSCs移植治疗组(C组),每组10只。3、ADSCs移植干预治疗骨质疏松模型SAMP6:收集原代培养传至第3代的脂肪源干细胞,无菌生理盐水重悬,制成浓度3×106 cells/mL细胞悬液。通过尾静脉向每只治疗组SAMP6注射脂肪源干细胞3×106个细胞,而每只模型对照组SAMP6、空白对照组注射1mL生理盐水,4周后检测。4、实验小鼠采用水合氯醛麻醉(微型计算机断层成像检测后),心脏取血,促凝管接取后在室温下放置8h,离心15min,3000r/min,取上清制备血清,分装后-70℃保存。血清睾酮(T)和骨钙素(BGP)水平测定用放免法；用黄嘌呤氧化酶法测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性,硝酸还原酶法测定血清NO,用硫代巴比妥酸(TBA)法测定血清丙二醛(MDA)含量。用全自动生化分析仪分别利用偶氮砷III法、磷钼酸比色法和速率法测定血清中钙、磷及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的含量。5、实验小鼠采用水合氯醛麻醉,利用micro CT测定腰椎、右侧股骨和右侧胫骨的三维骨形态计量参数。Micro CT扫描完成后,于距离生长板远端1.0mm选取层厚3.0mm骨组织来对松质骨的感兴趣区域(region of interest, ROI)进行三维重建。以micro CT自带机载软件定量分析获取的重建图像：骨密度(bone mineral density, BMD)、骨体积分数(bone volume/total volume, BV/TV)、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁分离度(trabecular separation, Tb. Sp)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、结构模型指数(structure model index, SMI)、各向异性度(degree of anisotropy, DOA)等。6、Micro CT检测完成后进行心脏取血并处死小鼠,取左侧股骨进行三点弯曲实验(采用BOSE生物材料动态力学试验机)检测,股骨前面朝下,背面朝上,设定18mm为跨距,0.05mm/s为速率,记录股骨受压情况,测量压断时的最大载荷和刚度值。7、Micro CT检测完成后,取处死的小鼠的右侧胫骨上1/3,沿矢状面剖开,先固定,酒精逐级脱水后,然后依次浸入(相应配比的甲基丙烯酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、或含过氧化苯甲酰)浸液中包埋：浸液Ⅰ、浸液Ⅱ和浸液Ⅲ各2天,再以新鲜配制的浸液Ⅲ对其进行包埋。完成后连续切取其6μm厚度的切片(使用Jung K重型切骨机),并分别进行Gemisa组织学染色观察及von Kossa类骨质染色观察。Lecia QWin彩色病理图像多功能分析软件来分析其生长板下1mm至4mm范围内的选择测量区域,进行单位骨小梁破骨细胞数(OC.N)检测等骨组织形态计量学分析(均采用国际通用的公式进行计算)。8、采用SPSS13.0统计软件处理,以均数±标准差(x±s)表示,方差齐时,多样本均数比较均采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法；方差不齐时,多样本均数比较均采用Welch法,两两比较采用Dunnett’s T3方法,P<0.05表示有统计学差异。结果1、光学显微镜观察显示,原代培养的ADSCs在24小时后大部分可贴壁,细胞呈梭形、多边形、圆形等。细胞长势良好,6天后按照1：3的比例传代,之后每3天传代一次。传至第5代的细胞形态均一,多呈纺锤形或多角形。流式细胞术检测发现CD90、CD29呈强阳性,CD106呈弱阳性,而CD49d、CD45和CDllb呈阴性。在ADSCs成脂诱导培养14天后,油红O染色可显示细胞浆内橙红色的特异性脂滴；成骨诱导培养21天后,茜素红染色可显示呈粉红色的特异性的矿化结节；定量PCR结果显示,经维甲酸诱导后ADSCs能表达生殖相关Oct4、Daz1、Nobox、Piwil四个基因,说明体外培养的ADSCs可以向成脂、成骨、成生殖方向诱导分化。2、SAMR1空白对照组、SAMP6模型对照组、ADSCs移植治疗组之间的血清睾酮含量比较差异有统计学意义(F=2816.581,P<0.001),与SAMR1空白对照组比较,SAMP6模型对照组小鼠血清睾酮水平有所降低(P<0.001),提示老年骨质疏松小鼠模型已复制成功；与SAMP6模型对照组比较,4周治疗后,ADSCs治疗组小鼠血清睾酮有所提高(P<0.001)。方差分析结果显示三组小鼠血清骨钙素(BGP)水平比较差异有统计学意义(F=104.017,P<0.001),SAMP6模型对照组小鼠血清BGP水平明显高于SAMR1空白对照组,差异具显著性(P<0.001)；经4周治疗后,ADSCs移植治疗组血清BGP水平较SAMP6模型组有所下降(P<0.001)。同时各组整体比较血清Ca (F=105.029,P<0.001)、P (F=30.858,P<0.001)及ALP (F=9.446,P<0.05)均有统计学意义。SAMP6模型对照组与SAMR1空白对照组比较,血清Ca和ALP(P<0.05)水平明显降低,血清P水平(P<0.05)则明显上升。与SAMP6模型对照组比较,ADSCs治疗组可显著提高血清Ca和ALP水平,但均低于空白对照组(P<0.05)；ADSCs治疗组血清P水平则明显低于模型组(P<0.01)。并且方差分析结果显示三组的血清SOD (F=235.044,P<0.001)、血清NO水平(F=286.880,P<0.001)、血清MDA水平(F=54.327,P<0.001)比较差异有统计学意义。SAMP6模型对照组与SAMR1空白对照组比较,血清MDA水平显著性升高(P<0.001),而血清SOD (P<0.001)、血清NO(P<0.001)均显著性降低,提示骨质疏松小鼠模型复制成功。相比SAMP6模型对照组,细胞移植治疗后骨质疏松小鼠SOD活性(P<0.001)、血清NO水平(P<0.001)有所提高,降低MDA水平(P<0.001)。3、SAMR1空白对照组、SAMP6模型对照组、ADSCs移植治疗组之间的骨强度(F=18.013,P<0.001)、骨刚度(F=35.133,P<0.001)、腰椎骨密度(F=38.220,P<0.001)、股骨骨密度(F=70.312,P<0.001)、骨小梁数量(F=131.291,P<0.001)、相对体积(F=85.962,P<0.001)和厚度(F=13.159,P<0.001)、骨小梁分离度(F=69.714,P<0.001)、结构模型指数(SMI) (F=600.711,P<0.001),各向异性度(DOA) (F=36.804,P<0.001)、单位骨小梁的破骨细胞数(F=456.168,P<0.001)显示比较差异均有统计学意义。相比SAMR1空白对照组小鼠,SAMP6模型对照组小鼠骨强度(P<0.001)、骨刚度(P<0.001)、腰椎骨密度(P<0.001)、股骨骨密度(P<0.001)均显著性降低,而骨小梁变细、变薄且排列紊乱,骨小梁连续性差且间距增大,出现断裂、陷窝；骨小梁数量(P<0.001)、相对体积(P<0.001)、厚度(P<0.001),及结构模型指数(P<0.001)均显著降低,而各向异性度(P<0.05)、骨小梁分离度(P<0.001)增高,单位骨小梁的破骨细胞数(P<0.001)增多。ADSCs移植治疗组与SAMP6模型对照组相比,其骨强度(P<0.001)、骨刚度(P<0.001)、腰椎骨密度(P<0.001)、股骨骨密度(P<0.001)均有升高,骨小梁的数量(P<0.001)、相对体积(P<0.001)、厚度(P<0.001)明显增加,而骨小梁分离度(P<0.05)、各向异性度(P<0.05)有所降低,结构模型指数(SMI)(P<0.05)有所增加,单位骨小梁破骨细胞数减少(P<0.05)。结论1、腹股沟皮下脂肪组织分离、培养增殖的脂肪源干细胞呈长梭形、多角形,可形成细胞集落。在ADSCs成脂方向诱导分化14d后,油红O染色细胞胞浆内可显示特异性的脂滴；成骨方向诱导分化21d后,茜素红染色可显示呈粉红色的特异性矿化结节；定量PCR结果显示,经维甲酸诱导后ADSCs能表达生殖相关Daz1、Oct4、Nobox、Piwil四个基因；该细胞经定向诱导后体外可以向成生殖、成骨、成脂肪分化,与间充质干细胞多向分化的功能一致。细胞表面标记物检测中,流式细胞术检测发现ADSCs的表面标志物CD90、CD29呈强阳性,CD106呈弱阳性,而CD49d、CD45和CDllb呈阴性。2、通过移植脂肪源干细胞可显著升高骨质疏松小鼠体内血清睾酮含量、骨钙素水平,可有效改善体内钙、磷代谢,为临床上骨质疏松症的研究和治疗提供了一种新的研究思路和方法;3、尾静脉移植脂肪源干细胞后,可显著升高骨质疏松小鼠体内血清SOD含量和NO水平,而且有效降低血清丙二醛(MDA)含量。4、尾静脉移植脂肪源干细胞后,Micro CT检测结合骨组织形态计量学分析(印证可互相补充且高度相关),可见骨质疏松小鼠骨密度、骨强度和骨刚度均明显增加；骨小梁数量增多且变厚、变粗,骨小梁间的连接性改善,陷窝明显减少；骨小梁的数量、相对体积和厚度明显增加,同时骨小梁分离度显著降低,各向异性度有所降低,结构模型指数有所增加,单位骨小梁的破骨细胞数减少。综上所述,移植异体脂肪源干细胞对自发老化骨质疏松小鼠可有效改善其骨微环境,改善骨小梁结构,促进骨矿化、骨形成,减少骨吸收,增加骨量,提高骨质量,并增强骨强度,改善骨生物力学性能从而降低骨折的发生率。本实验进一步提示脂肪源干细胞移植将或能从根本上改善骨质疏松症病情,直接或间接促进骨组织的形成,因此,这种防治方法具有极大的潜在可能性。