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目的:随着NICU救治技术的发展,小胎龄早产儿的存活率不断提高,但随之而来,支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)的发病率逐年上升。BPD是早产儿常见的呼吸系统疾病之一,以肺泡发育不良为主要特点,其主要病理特征为肺泡数量少、体积大、结构简单化并伴随肺微血管发育不良,其远期结局主要有反复呼吸道感染、气道高反应性、肺功能异常等。因此探寻肺泡发育障碍的关键机制亟待解决。肺泡II型上皮(type II alveolar epithelial cells,AECII)作为肺泡上皮中的“干细胞”,在肺损伤时能够分化成为AECI,共同维持肺泡结构的稳定,保证肺泡表面积,在肺组织修复过程中发挥重要作用。在本课题组前期对BPD模型超微结构进行观察时,我们发现AECII线粒体发生了体积变小、外膜断裂、嵴结构消失等改变,这种特征性改变符合一类新型细胞死亡模式-铁死亡(Ferroptosis)。铁死亡是一类Fe依赖性的氧化损伤引起的细胞死亡模式。这一细胞死亡过程与凋亡、坏死和自噬在形态学特征及生理生化方面均有差异。目前针对铁死亡的研究主要集中在肿瘤、神经退行性疾病、缺血再灌注损伤等。铁死亡发生机制,如铁离子代谢失衡、氧化应激及谷氨酸代谢异常等,与BPD的发病机制存在较多共性,然而这种死亡形式是否参与BPD的发生尚不明确。目前认为,氧化/抗氧化系统失衡所带来的氧化应激损伤是BPD最主要的损伤形式。Nrf2,是生物体内抗氧化系统的核心基因,在体内广泛表达,其下游多种靶基因能够参于铁死亡的调节。目前Keap1-Nrf2抗氧化系统保护机制在许多治疗中的应用已经进行到临床前研究阶段,但Nrf2激动剂应用于防治BPD的研究结论尚存争议,因此探究Nrf2参与BPD发生发展的明确机制至关重要。自噬,是维持生物内环境稳态的重要机制,且是肺发育中的必须生物学行为,在抗氧化反应中同样发挥重要作用,已有研究表明自噬与Keap1-Nrf2通路通过p62存在交叉调节,且过度自噬已被证实参与BPD的发生,然而自噬激动剂雷帕霉素却能够修复肺泡发育不良,其机制尚不明确。因此,本研究拟验证AECII铁死亡在肺泡发育不良中的影响;研究Keap1-Nrf2通路在调节AECII铁死亡中的作用;探索雷帕霉素能否通过影响Keap1-Nrf2途径对AECII铁死亡产生调节。预期阐明BPD中AECII铁死亡的分子调控机制,为BPD的有效防治提供新的靶点。研究方法:第一部分:1.制备BPD动物模型,将新生Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为模型组(Fi O2=0.8)和对照组(Fi O2=0.21),于实验后的3、7、10、14天,每组随机取8只收集肺组织标本,随机选取8只提取原代AECII,在组织水平进行HE染色观察病理改变,透射电镜下观察线粒体形态变化,在组织和原代AECII水平应用Western blot检测PTGS2、GPx4、FTH1蛋白水平表达,RT-PCR检测PTGS2、GPx4、FTH1 m RNA水平表达。2.抑制BPD大鼠铁死亡,将新生SD大鼠随机分为3组,铁死亡抑制剂干预组(Fi O2=0.8,Liproxstatin-1,10mg/kg,QD,IP)、模型组(Fi O2=0.8)与对照组(Fi O2=0.21),于实验后14天,每组随机选取8只收集肺组织标本,HE染色观察病理结局,透射电镜下观察线粒体形态变化,Western blot检测PTGS2、GPx4、FTH1蛋白表达,Ki67染色观察肺组织增殖能力,γ-H2AX染色观察肺组织损伤情况。3.建立体外高氧暴露细胞模型,提取生后12h内SD大鼠原代AECII,分为铁死亡抑制剂干预组(Fi O2=0.8,Lip-1,200n M)、模型组(Fi O2=0.8)和对照组(Fi O2=0.21),于培养48h后收获细胞,Western blot检测PTGS2、GPx4、FTH1蛋白表达,Ki67染色检测细胞增殖能力,γ-H2AX染色检测细胞DNA损伤情况。第二部分:制备BPD动物模型,将新生SD大鼠随机分为2组,模型组(Fi O2=0.8)和对照组(Fi O2=0.21)。于实验后的3、7、10、14天,每组随机选取8只收集肺组织标本,随机选取8只提取原代AECII,应用Western blot检测p62、p62(p-S351)、Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC蛋白水平表达,RT-PCR检测Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC m RNA水平表达,应用核浆分离技术检测细胞核内Nrf2蛋白表达与细胞浆内Nrf2蛋白表达,免疫组化观察Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC的表达及定位,免疫荧光双染检测Nrf2-Keap1、p62-Keap1、p62(p-S351)-Keap1的共定位。第三部分:促进BPD大鼠自噬进程,将新生SD大鼠随机分为3组,自噬激动剂干预组(Fi O2=0.8,Rapamycin,10mg/kg,QOD,IP)、模型组(Fi O2=0.8)与对照组(Fi O2=0.21),于实验后14天,每组随机选取8只收集肺组织标本,HE染色观察病理结局,免疫组化观察Nrf2蛋白表达及分布,核浆分离技术检测细胞核内Nrf2蛋白表达与细胞浆内Nrf2蛋白表达,western blot检测PTGS2、GPx4、FTH1蛋白表达,p62、p62(p-S351)、Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC蛋白表达,免疫荧光双染检测Nrf2-Keap1、p62-Keap1、p62(p-S351)-Keap1的共定位。结果:第一部分:1.肺组织的形态学及超微结构的改变:光镜下HE染色结果提示,与对照组相比,模型组RAC值于7d、10d明显低于对照组(P<0.05),于14d差异更加显著(P<0.01);肺泡间隔厚度于7d、10d明显高于对照组(P<0.05),于14d差异更加显著(P<0.01)。透射电镜下可见,模型组AECII于7d开始出现线粒体出现体积减小,嵴结构消失,外膜皱缩、断裂等现象。2.肺组织及AECII内铁死亡相关蛋白及m RNA表达情况:蛋白水平,与对照组相比,模型组肺组织中PTGS2于7d开始升高,GPx4则于7d开始降低,FTH1持续明显低于对照组(P<0.05)。与对照组相比,模型组原代AECII内,PTGS2表达升高,于10开始差异显著,GPx4于7d开始下降显著,FTH1持续明显低于对照组(P<0.05)。m RNA水平,与对照组相比,模型组肺组织中PTGS2持续升高,GPx4于7d开始降低,FTH1持续明显低于对照组(P<0.05)。与对照组相比,模型组原代AECII内,PTGS2于7d开始表达升高,GPx4于7d开始下降显著,FTH1持续明显低于对照组(P<0.05)。3.Liproxstatin-1对BPD肺组织及AECII的影响:应用铁死亡抑制剂后,与模型组相比,14d干预组肺组织RAC值增加(P<0.05),肺泡间隔变薄(P<0.05)。透射电镜下可见,干预组AECII内线粒体结构较模型组更加完整。肺组织内PTGS2蛋白表达降低(P<0.05),GPx4、FTH1蛋白表达升高(P<0.05),Ki67与γ-H2AX阳性标记细胞比率均减少(P<0.05),与对照组无明显差异。应用铁死亡抑制剂后,与模型组相比,干预组AECII内PTGS2蛋白表达降低(P<0.05),GPx4、FTH1蛋白表达升高(P<0.05),Ki-67阳性标记细胞比率明显调(P<0.05),γ-H2AX阳性标记细胞比率显著下降(P<0.05),与对照组无明显差异。第二部分:p62-Keap1-Nrf2通路在BPD肺组织及AECII内的表达情况:与对照组相比,模型组肺组织及AECII内Nrf2总蛋白表达升高(P<0.05),Nrf2核蛋白于3d、7d、10d表达增多(P<0.05),Nrf2浆蛋白于7d、10d、14d表达升高(P<0.05)。与对照组相比,模型组肺组织内HO-1、NQO1蛋白表达增高(P<0.05),肺组织内HO-1 m RNA表达持续增高(P<0.05),NQO1 m RNA表达于3d、7d、10d增多(P<0.05),GCLC m RNA表达于3d、7d升高(P<0.05);AECII内HO-1、NQO1、GCLC蛋白表达增高(P<0.05)。与对照组相比,模型组肺组织及AECII内Keap1蛋白表达从7d开始增高(P<0.05),而模型组肺组织内Keap1 m RNA表达则从7d开始低于对照组(P<0.05)。与对照组相比,模型组肺组织内p62于7d、10d表达上升,p62(p-S351)从7d开始表达提高,p62(p-S351)/p62比率从10d开始增加(P<0.05);AECII内p62于7d、14d表达上升,p62(p-S351)从3d开始表达提高,p62(p-S351)/p62比率从7d开始增加(P<0.05)。免疫荧光双染及共定位散点图分析可见,7d模型组内Nrf2-Keap1、p62-Keap1、p62(p-S351)-Keap1共定位均较对照组明显增加(P<0.05)。第三部分:雷帕霉素对BPD肺组织的影响:应用自噬激动剂雷帕霉素后,与模型组相比,14d干预组肺组织RAC值增加(P<0.05),肺泡间隔变薄(P<0.05)。干预组Nrf2蛋白核内表达明显增加(P<0.01),浆内表达减少(P<0.05),总蛋白无明显变化。干预组HO-1蛋白表达降低(P<0.01),NQO1、GCLC蛋白表达明显升高(P<0.01)。干预组Keap1、p62、p62(p-S351)蛋白表达下降(P<0.05),p62(p-S351)/p62比率降低(P<0.05)。干预组Nrf2-Keap1、p62-Keap1、p62(p-S351)-Keap1的共定位较模型组减弱(P<0.05)。干预组肺组织内PTGS2蛋白表达下降(P<0.05),GPx4、FTH1蛋白表达上升(P<0.05)。结论:1.在BPD新生大鼠模型中,存在AECII铁死亡事件,且抑制新生BPD大鼠体内铁死亡,可改善BPD的肺泡发育结局,提示铁死亡参与了BPD的发生发展。2.在BPD新生大鼠模型中,Nrf2-ARE途径被激活,然而p62-Keap1复合物降解障碍致Nrf2胞浆潴留,使得被激活的Nrf2-ARE途径不足以逆转BPD大鼠肺泡发育不良。3.在BPD新生大鼠模型中,雷帕霉素能够促进p62-Keap1复合物降解,上调Nrf2核转运,抑制铁死亡,改善BPD大鼠肺泡发育,为未来BPD的防治提供新的理论依据。