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背景脑卒中是世界上导致残疾与死亡最多的疾病,其中缺血性脑卒中占所有脑卒中的87%。因为脑缺血损伤主要作用于神经元,所以先前对脑缺血耐受机制的研究基本集中在神经元上。随着对中枢神经系统的深入研究,发现胶质细胞不但具有支持和滋养神经元的作用,而且还能与神经元相互作用,参与多种生理病理过程。小胶质细胞是大脑固有的免疫细胞,具有调控炎症反应的作用,在中枢神经系统发挥前哨监视功能。炎症反应是影响脑缺血损伤后期功能恢复的关键。研究发现,小胶质细胞在不同的损伤环境中可以极化为不同的细胞亚群而发挥不同的功能。小胶质细胞在脑缺血后可活化为M1型,启动免疫级联反应,产生大量氧化产物和促炎因子,在消灭入侵的微生物时,也会损伤正常组织。M2型小胶质细胞抑制过度的免疫反应,促进神经元再生。如何调控小胶质细胞的活化,抑制其对神经元的损伤,已成为预处理产生脑保护作用机制研究的焦点。研究发现小胶质细胞表达CB2R,激活小胶质细胞上的CB2R,具有神经保护作用。CB2R不仅可以调控小胶质细胞增殖、分化和迁移,而且可以降低其神经毒性反应。本课题组的前期研究发现,电针预处理在脑缺血后可以激活内源性大麻素系统,促进内源性大麻素受体表达,发挥脑保护作用。但是激动CB2R能否通过调控小胶质细胞活化状态诱导脑缺血耐受作用仍需进一步探索。基于以上背景,本实验以电针和CB2R为核心,以小胶质细胞为切入点,利用SD大鼠短暂局部脑缺血模型,采用Western Blot、ELISA、免疫荧光染色等研究方法,从分子、细胞和组织等多个层面,明确激动CB2R能否调控小胶质细胞活化状态,在脑缺血后发挥神经保护作用,以求进一步阐明电针预处理诱导脑缺血耐受的机制。实验一、脑缺血再灌注后半暗带内小胶质细胞数量和形态的变化目的:观察小胶质细胞在脑缺血再灌注后半暗带内数量和形态的变化。方法:随机将成年雄性SD大鼠分为2组:假手术组(sham)和缺血再灌注组(I/R),缺血再灌注后6小时、24小时、3天和7天将动物处死取脑做冰冻切片,利用免疫荧光染色和三维重建技术观察脑缺血再灌注后不同时间点半暗带内小胶质细胞数量和形态的变化。结果:免疫荧光染色显示,与sham组相比,I/R 3d组、7d组可见小胶质细胞在半暗带内的数量明显增多(P<0.05,vs.sham)。三维重建显示缺血再灌注后,小胶质细胞由静息时的分枝状逐渐转变为阿米巴状。结论:脑缺血再灌注后,半暗带内小胶质细胞数量明显增加,突起明显减少。实验二、脑缺血再灌注后半暗带内小胶质细胞活化状态的变化目的:检测脑缺血再灌注后不同时间点半暗带内小胶质细胞活化状态的变化。方法:随机将成年雄性SD大鼠分为2组:假手术组(sham)和缺血再灌注组(I/R),缺血再灌注后6小时、24小时、3天和7天将动物处死取脑,利用Western Blot、ELISA和免疫荧光染色,测定不同时间点半暗带内小胶质细胞M1/M2型特异性标志分子的表达情况。结果:Western Blot结果显示,与sham组相比,M1型特异性标志分子IL-1β表达水平在I/R 6h最高,i NOS在24h最高;M2型特异性标志分子Arginase和BDNF在I/R7d表达明显增多(P<0.05,vs.sham)。ELISA结果显示,与sham组相比,M1型标志分子TNF-a和CD68在I/R 24h表达最多,M2型标志分子IL-10和CD206表达水平在I/R 7d最高(P<0.05,vs.sham)。结论:脑缺血后,小胶质细胞M1型标志分子主要表达于再灌注后24小时,M2型标志分子主要表达于再灌注后7天。实验三、电针预处理对脑缺血再灌注后小胶质细胞活化状态的影响目的:脑缺血后,小胶质细胞活化。本实验欲观察电针预处理是否影响脑缺血再灌注后小胶质细胞的活化状态。方法:随机将成年雄性SD大鼠分为3组:假手术组(sham)、缺血组(MCAO)和电针预处理组(EA+MCAO)。缺血再灌注后3天取材进行Western Blot,检测半暗带内小胶质细胞M1/M2型特异性标志分子的表达水平。结果:Western Blot结果显示,与MCAO组相比,EA+MCAO组半暗带内小胶质细胞M2型标志分子Arginase和BDNF表达上调(P<0.05,vs.MCAO),M1型特异性标志分子IL-1β和i NOS表达下调(P<0.05,vs.MCAO)。结论:电针预处理可上调脑缺血再灌注后半暗带内小胶质细胞M2型标志分子,下调M1型标志分子的表达。实验四、电针预处理通过CB2R对脑缺血再灌注后小胶质细胞活化状态的影响目的:以上实验证实电针预处理可上调脑缺血再灌注后半暗带内小胶质细胞M2型标志分子,下调M1型标志分子的表达,但电针预处理通过何种机制影响小胶质细胞活化状态尚不明确。本课题组在前期研究中发现内源性大麻素系统活化是电针预处理诱导脑缺血耐受的重要机制之一。故本实验欲探究电针预处理是否通过CB2R影响小胶质细胞的活化状态。方法:1.CB2R激动剂AM1241对缺血再灌注后小胶质细胞活化状态的影响随机将成年雄性SD大鼠分为4组:假手术组(sham)、缺血组(MCAO)、CB2R激动剂AM1241组(AM1241+MCAO)和溶剂组(Vehicle+MCAO)。大鼠缺血再灌注后3天处死取脑,行Western Blot检测小胶质细胞M1/M2型标志分子的表达水平。2.CB2R拮抗剂AM630对缺血再灌注后小胶质细胞活化状态的影响随机将成年雄性SD大鼠分为5组:假手术组(sham)、缺血组(MCAO)、电针预处理组(EA+MCAO)、CB2受体拮抗剂AM630组(AM630+EA+MCAO)和溶剂组(Vehicle+EA+MCAO)。大鼠缺血再灌注后3天处死取脑,行Western Blot检测小胶质细胞M1/M2型标志分子的表达水平。结果:Western Blot结果显示,与MCAO组相比,AM1241组Arginase表达水平升高,IL-1β表达水平降低,溶剂组与缺血组之间没有明显区别(P<0.05,vs.MCAO)。与EA+MCAO组相比,AM630组i NOS表达水平增高,BDNF表达水平降低,溶剂组和电针组之间无统计学差异(P<0.05,vs.EA+MCAO)。结论:电针预处理能够通过CB2R调控小胶质细胞的活化状态。小结:通过以上研究发现,脑缺血再灌注后,小胶质细胞活化,半暗带内的Iba1阳性小胶质细胞数量增加,形态从静息的分支状转变为圆形的阿米巴状。M1型标志分子主要表达于缺血再灌注后24小时,M2型标志分子主要表达于缺血再灌注后7天。电针预处理能下调M1型标志分子的表达水平,上调M2型标志分子的表达水平,促使小胶质细胞由M1型向M2型转化。进一步研究证实,给予CB2R拮抗剂AM630可以部分上调电针预处理后i NOS的表达,下调电针预处理后BDNF的表达,说明电针预处理通过CB2R调控小胶质细胞活化状态诱导脑缺血耐受。综上所述,电针预处理通过CB2R调控小胶质细胞活化状态发挥脑保护作用。