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9号和22号染色体相互易位形成融合基因bcr／abl，是慢性粒细胞性白血病（CML）的主要发病机制。bcr／abl所编码的融合蛋白p210BCR/ABL具有异常增高的酪氨酸激酶活性，与白细胞的恶性转化密切相关。研究发现，bcr／abl融合基因中bcr基因第一外显子（即bcr／abl的第一外显子bE1）所编码的肽段为激活原癌蛋白c—ABL的酪氨酸激酶活性所必需。本课题拟利用定点打靶系统Cre／loxP系统作用原理，通过同源重组将loxP序列引入CML细胞系K562基因组的bE1两侧，并通过调控Cre酶的表达调控细胞内bE1基因的敲除过程，观察bE1敲除后K562细胞在生长、转移及致癌性等方面的变化，从而为深入阐明CML的发病机理、演变过程、改善治疗方案及估计预后提供有力的理论依据。 我们首先通过四方面的实验全面分析和检验了我们所采用的基因打靶体系的有效性：1)利用染色体检查和核型分析检测了K562细胞内染色体的数目和特点，同时采用原位荧光杂交（FISH）测定了细胞内bcr／abl融合基因的拷贝数和分布情况。染色体检查和核型分析结果显示，K562细胞核内有67～69条染色体，其中22条染色体有2～3条，未见典型的Ph′。而FISH结果却表明，K652细胞虽然没有Ph′，但却有三对或多对bcr／abl或abl／bcr融合基因，无论是bcr、abl还是二者产生的融合基因都存在过度扩增现象。结果表明，K562可以作为针对bcr／abl的基因打靶的靶细胞；不过由于bcr／abl过度扩增，可能需要多次打靶才能观察到打靶的效果。2)应用Tet—on系统的作用原理，分别构建了调控蛋白的表达载体pIREShyg2-rtTA及Cre酶表达载体pTREneo-Cre（含有Tet反应元件TRE），将这两种载体联合转染后，以不同浓度强力霉素（Dox）诱导Cre酶的表达，Western blot检测结果显示：Dox可通过激活调控蛋白rtTA，显著诱导细胞中Cre酶的表达，Cre表达水平与Dox浓度呈正相关。这一结果说明我们建立了可调控型Cre酶的表达体系，为下一步对基因打靶进行调控打下了基础。3)将不同剂量的K562细胞通过尾静脉注射到NOD／SCID小鼠体内，观察尾静脉注射K562细胞对小鼠存活的影响，并对死亡小鼠的内脏进行病检。结果显示，静脉注射1×106～107K562细胞后，除1×106注射的小鼠外，其余剂量组小鼠均发生急性白血病并在13～49天内死亡，小鼠存活时间与注射细胞剂量之间呈明显的负相关关系；死亡小鼠极度消瘦，内脏病检可见肿瘤细胞浸润，有三只小鼠大脑组织中亦可见到肿瘤细胞浸润，这是静脉注射K562细胞导致中枢神经系统白血病的首例报道。上述结果表明NOD／SCID小鼠可作为尾静脉注射K562诱发白血病的良好模型。4)利用PCR分别扩增bE1序列、紧邻其上游、下游的内含子序列以及Abl基因第