论文部分内容阅读
百合(Lilium spp.)是百合科百合属多年生草本球根花卉,百合花具有美丽的色彩和宜人的香气,是世界上主要切花之一。百合有着“百年好合、百事合意”的美好寓意,受到广大消费者的喜爱。然而,百合花药含花粉量巨大,大量散出的花粉不仅污染花瓣,影响观赏价值,同时一些花粉还会通过接触到人体的皮肤及粘膜,引起鼻炎、皮肤炎症、呼吸困难等过敏症状,严重的可能导致休克。花粉过敏严重影响着易感人群的生活质量。随着居民生活水平的不断提高,切花百合在家庭装饰中的逐渐普及,花粉量大导致的花粉过敏问题引起了人们的重视,从而也在一定程度上限制了切花百合的应用。因此,分析鉴定百合花粉中潜在的过敏原,对后续防治百合花粉过敏问题有着重要的意义。为了探索百合花粉中是否有潜在的过敏原及鉴定百合花粉过敏原相关的基因,本研究使用东方百合品种‘西伯利亚’为试验材料,比较鉴定了不同发育阶段百合花粉的形态特征及其对应的花药发育时期,选取单核早期花粉和成熟期花粉进行转录组、蛋白组测序,分析了两个时期差异表达的基因和蛋白,并进一步对转录组数据进行挖掘,筛选百合花粉潜在的过敏原信息,对筛选得到的相关基因进行克隆及生信分析。主要研究结果如下:(1)通过组织学和细胞学研究,将百合花粉发育过程分成6个主要阶段:造孢细胞时期、花粉母细胞时期、减数分裂时期、四分体时期、单核早期、成熟期。明确了百合花蕾及花药形态特征与花粉发育时期的相关性。发现了百合单核早期花粉即开始形成明显的花粉壁,花粉壁具有网状结构;成熟期的百合花粉花粉壁明显增厚,且有萌发沟。(2)为了对百合花粉蛋白进行研究和分类,进而筛选过敏原蛋白,本研究对‘西伯利亚’单核早期花粉和成熟期花粉分别取样进行了 TMT蛋白组测序,并基于GO,KEGG,COG和IPR四个数据库对所测蛋白质进行了功能注释,分别注释了数量为6301,10636,4844和8911的蛋白质。通过比较取样的两个时期的测序结果发现差异表达显著的蛋白总数为2328,其中表达量上调的蛋白有886个,下调的蛋白有1442个。在百合花粉蛋白组数据中,百合单核早期花粉中与花粉外壁结构形成相关的蛋白相对表达量较高;而百合成熟花粉中有多种蛋白被注释为过敏原相关蛋白,其中c32116g1 和 c40755g2 为泛过敏原蛋白 profilin,c31533g1 和 c24431g1 被注释为polcalcin家族中的Ph1 p 7过敏原,这些蛋白表达量在成熟花粉时期明显高于单核早期。(3)对‘西伯利亚’单核早期花粉和成熟期花粉分别取样进行高通量转录组测序,获得了 19.04Gb 数据;根据 NCBI,Nr,Nt,Pfam,KOG,Swiss-Prot,KEGG 和GO七大数据库对基因进行功能注释,筛选得到了 22835个差异表达基因(DEGs),其中上调基因8390个,下调基因14445个。筛选出了差异表达的花粉过敏原相关的候选基因,如 Profilin(c32116g1),Phlp 7(Polcalcin,c24431g),Olee1 和 Phl p11,结合蛋白质组学分析结果发现候选的花粉致敏蛋白在蛋白水平也有显著增加。对候选的致敏基因c32116g1和c24431g1进行进化树分析发现它们分别与已鉴定的profilin和polcalcin家族过敏原同源性最高,暗示百合花粉中存在潜在表达的过敏原基因。(4)通过基因克隆的方法,从百合‘西伯利亚’中分离出两个泛过敏原基因LoProfilin和LoPolcalcin,它们的开放阅读框长度分别为396 bp和246 bp,预测分别编码131和81个氨基酸。同其他物种的同源蛋白进行氨基酸序列比对显示LoProfilin和LoPolcalcin在进化上高度保守,序列基本一致;亚细胞定位结果表明,LoProfilin和LoPolcalcin在整个细胞中均有分布;三级结构预测分析结果表明LoProfilin和LoPolcalcin具有典型的profilin和polcalcin家族过敏原的空间结构,暗示了它们可能是百合花粉中的过敏原。实时荧光定量PCR分析基因时空表达的结果表明,LoProfilin在花粉中的表达量远高于其他组织,在原有花粉发育阶段的基础上,将其中的成熟期进一步划分为成熟1、2、3时期,在花粉发育的过程中,表达量持续增加,成熟期后期(成熟期3)达到最高;LoPolcalcin在百合成熟花粉中特异表达,其余发育阶段均无明显表达,且表达量随着花粉成熟阶段的深入而逐渐增加。本研究为探究百合中是否存在潜在的过敏原提供了依据,为百合花粉过敏原的研究奠定基础。