研究背景和目的糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)的患病率在全世界范围内急剧上升,已成为威胁人类健康的最重要疾病之一。中国同样面临糖尿病人群增长的问题,并已成为DM患者最多的国家,比任何其他国家面临更大的DM相关负担。糖尿病时的长期代谢异常能够引起多种并发症,其中心血管疾病,尤其是缺血性心脏病(Ischemic Heart Disease, IHD)已经成为导致糖尿病人死亡的主要原因。近期有研究表明,高血糖对心肌细胞有直接的损害,表现为心肌缺血后更频繁的心率失常、更广泛的梗死面积等,即糖尿病心脏对缺血损伤敏感性增加,但是其具体机制并不十分清楚。近年来研究表明,DM时由于血浆葡萄糖水平增高,葡萄糖及其衍生物对蛋白质发生非酶糖化(nonenzymatic protein glycation)修饰,即在高浓度的葡萄糖环境下,不经酶催化,葡萄糖分子游离醛或酮基与蛋白质氨基反应而渗入蛋白质分子形成糖化蛋白的过程。蛋白质功能与其结构密切相关,当其发生化学修饰后,生物学效应将发生变化,因此,蛋白质非酶糖化被认为是DM致病的主要机制之一。有研究证实,非酶糖化蛋白质属于晚期糖化终末产物(advanced glycation end-products, AGEs),可以激活氧化酶增加心肌细胞的活性氧代谢物ROS,促进心肌细胞凋亡,增加DM心肌缺血梗死面积,降低其心功能。但是AGEs是一大类物质,其中非酶糖化蛋白质类物质增加心肌缺血损伤敏感性过程中的下游分子通路还不清楚。硫氧还蛋白(Thioredoxin, Trx)是一种广泛存在于人体内的小分子蛋白,具有氧化还原调节功能。近年来越来越多的证据表明,Trx在促进细胞增殖／生存和减少细胞死亡方面起重要作用。蛋白质的结构与其功能密切相关,当其结构发生变化时,生物功能也随之变化。我们前期研究中,使用葡萄糖代谢物丙酮醛体外直接孵育提纯的Trx,通过免疫印迹方法检测到明显的非酶糖化物质标记物,提示Trx在高糖作用下可能发生了非酶糖化修饰。基于这些事实,我们推测,糖尿病时,高浓度葡萄糖及其代谢物导致机体组织中Trx发生非酶糖化反应,Trx活性下降,导致其功能,尤其是抗凋亡生物学效应减弱,进而通过下游一系列信号转导过程促进凋亡发生,增加心肌缺血损伤敏感性。因此,本研究将验证上述假说,即通过制备糖尿病大鼠模型,并联合应用AGEs分解剂ALT-711明确：(1)糖尿病大鼠心肌组织Trx是否发生非酶糖化修饰,以及该修饰是否影响其活性；(2)Trx发生非酶糖化修饰是否增加糖尿病大鼠缺血／再灌注损伤的敏感性。材料和方法1.选取6周龄雄性Wistar大鼠,随机分为3组：正常对照组(Control组),糖尿病组(DM组),糖尿病+AGEs分解剂处理组(DM+ALT-711组)。Control组饲喂正常饲料,DM组和DM+ALT-711组饲喂高糖高脂饲料,即由基础饲料按比例添加蔗糖,炼猪油和蛋黄搭配制作。饲养4周时,DM组和DM+ALT-711组大鼠一次性腹腔注射40mg/kg STZ,48小时后测空腹血糖,血糖值大于11.1mmol/L为造模成功,Control组腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。DM+ALT-711组于第12周起,灌胃给予ALT-711(40mg/kg),连续8周。每周称量大鼠体重,并通过鼠尾采血监测大鼠血糖变化。分别于实验第0、4、6、8、12、16、20周,取大鼠心肌组织进行检测。通过免疫组化方法检测AGEs表达情况,通过WesternBlot方法检测Trx表达,通过胰岛素还原法检测Trx活性变化,通过免疫共沉淀方法检测Trx非酶糖化发生情况。2.6周龄雄性Wistar大鼠,分组和糖尿病模型制备方法同上,各组于第20周随机分为缺血／再灌注手术组和伪手术组,行心肌缺血30分钟／再灌注3小时。通过颈动脉插管检测大鼠左心室功能；以Evan’s Blue和TTC双染色法检测心梗面积；取心肌组织分别通过TUNEL法和caspase-3活性检测测定心肌细胞凋亡指标。结果1.各处理组大鼠体重和血糖水平DM组和DM+ALT-711组大鼠在高糖高脂饲料喂饲4周后体重增加较Control组明显,在注射STZ诱导糖尿病后,体重下降,第8,12,16和20周时均较同时间点Control组明显降低(P<0.05)。DM组和DM+ALT-711组大鼠在单纯高糖高脂饲料喂饲4周时,血糖升高不明显,与Control组相比,未见显著差异；第4周,腹腔注射STZ破坏胰岛功能,血糖迅速升高,较control组相比有显著差异(P<0.01)。之后DM组和DM+ALT-711组大鼠继续喂饲高糖高脂饲料,血糖水平持续维持在高水平,与各时间点Control组相比均有显著差异(P<0.01)。2.糖尿病大鼠心肌组织Trx活性降低,表达无明显改变。实验过程中,分别在第0、4、6、8、12、16、20周留取各处理组心肌组织,检测Trx活性。Control组大鼠心肌组织Trx活性在实验过程中无明显改变。高糖高脂饲料喂饲第8周(STZ注射后第4周)时,DM组和DM+ALT-711组大鼠心肌组织Trx相对活性开始下降,明显低于Control组(P<0.05)。DM组Trx活性至16周时,达到最低,并持续至第20周。而DM+ALT-711组大鼠在第16、20周时,心肌组织Trx相对活性较DM组大鼠升高。在检测心肌组织Trx活性同时,通过WesternBlot方法检测各组Trx表达情况,结果表明,各组Trx表达均未有改变。3.糖尿病大鼠心肌组织有明显AGEs生成,Trx发生非酶糖化修饰。实验过程中,分别在第0、4、6、8、12、16、20周留取各处理组心肌组织,通过免疫组化方法检测心肌组织AGEs表达,结果观察到,Control组大鼠心肌组织未见明显AGEs表达；DM组大鼠心肌组织从第6周(即糖尿病模型建立2周)开始表达AGEs,之后逐渐增加,至第12周(即糖尿病模型建立8周)达到稳定。免疫共沉淀结果显示,DM组在第8、12、16、20周,检测到心肌组织的Trx非酶糖化修饰。4. AGEs分解剂减少糖尿病引起的心肌组织AGEs表达,Trx非酶糖化修饰和Trx活性降低。DM+ALT-711组大鼠在ALT-711灌胃处理前,心肌组织从第6周开始表达AGEs,之后逐渐增加,至第12周达到稳定；在第8、12、16、20周,通过免疫共沉淀,均检测到心肌组织的Trx非酶糖化修饰。ALT-711处理之后,心肌组织AGEs表达自第16周开始下降；免疫共沉淀结果显示,第16和20周心肌组织Trx非酶糖化修饰程度降低,而Trx活性降低亦被部分逆转。5. Control组大鼠心肌缺血／再灌注引起心肌梗死、心功能降低和细胞凋亡增加,与其相比,DM组大鼠心肌缺血、再灌注后梗死面积进一步加大,心功能进一步恶化,Caspase相对活性更高,心肌细胞凋亡指数明细增高。而给予ALT-711处理后,能够部分减弱糖尿病加重的心肌缺血／再灌注损伤。结论糖尿病发生发展过程中,心肌组织中硫氧还蛋白发生非酶糖化修饰,导致其功能活性下降,引起心肌对缺血／再灌注损伤敏感性增加,表现为缺血心肌梗死面积加大,心功能恶化加重和细胞凋亡发生增多等。临床预防和治疗糖尿病并发症时,可以通过减少硫氧还蛋白非酶糖化修饰发生,或者降解生成的非酶糖化物质恢复硫氧还蛋白活性,抑制组织器官损伤。