背景：β-地中海贫血(β-地贫)是世界上最常见的遗传病之一。β-地中海贫血是由于β-珠蛋白基因(HBB)点突变或者小片段缺失引起β-珠蛋白链合成减少或缺乏,从而导致血红蛋白四聚体α-链/非α-链之间失去平衡所引起的一种中重度溶血性单基因遗传病。全球约有4.5％的携带者，而我国南方的广东、广西等省份尤为多见，其中广东省高达10%，虽然产前诊断的飞速发展可以防止很多地贫患儿的出生,但是我国每年仍有不少的患儿出生。重型β-地中海贫血患儿需要长期输血及螯合铁治疗，并且不规范治疗多在青少年死亡，给社会和家庭带来了严重的经济和精神心理负担。目前,造血干细胞移植是唯一的根治方法,但供体来源不足是治疗的瓶颈，许多β-地中海贫血患者因无合适的供体而得不到有效的治疗。另外，基因治疗，通过病毒导入正常 HB基因到病人体内是一个有希望的治疗方案，但是其在临床使用仍然面临着病毒整合的长期安全性问题。通过基因修复后的诱导多能干细胞（iPSCs）进行诱导造血分化为造血干细胞后输入患者体内是近年来发展起来的被认为最有希望治疗β-地贫的新方法。近期的一些体外研究已证明其修复后的iPSCs可正常分化为造血干细胞并且可继续成熟为具有表达HBB珠蛋白的红细胞。虽然这种方法是患者自体细胞，因此细胞来源不存在伦理问题，也没有免疫排斥，但是它仍有外源基因随机整合、致癌可能和基因修复过程导致脱靶效应引起基因突变等风险，因此，在临床应用前，必须对其进行系统研究及动物体内实验进行安全性及有效性的探讨。　　第一部分CRISPR/Cas9修复纯合突变的β-地贫iPSCs在NSI小鼠体内的研究　　目的：基因修复后的β-地中海贫血（β-地贫）诱导多能干细胞（iPSCs）定向造血干细胞分化后自体移植是一个目前最为理想的治疗方法。因此本部分旨在探讨（1）CRISPR/Cas9修复纯合突变的β-地贫iPSCs在NSI小鼠体内是否可以分化、存活和红细胞表达beta珠蛋白及其是否导致肿瘤的发生。（2）不同组织来源（皮肤及外周血）的iPSCs造血分化的体内外差异及肿瘤形成的差异。　　方法：　　1.利用 CRISPR/Cas9基因修复的方法对使用仙台病毒建立的非整合纯合突变的β-地贫iPSCs进行基因修复。并对修复后的β-地贫iPSCs进行多能性检测。　　2.利用OP9（小鼠骨髓基质细胞）共培养的方法对实验用到的各种iPSCs（包括正常人皮肤来源的 iPSCs（ niPSCs-1）、正常人血液来源的 iPSCs（niPSCs-2）、纯合突变的β-地贫 iPSCs（piPSCs）、纯合突变修复后的 iPSCs（ciPSCs）和人胚胎干细胞（hESCs））进行造血分化。　　3.通过磁珠分选CD34阳性的造血干细胞，移植前12-24小时，用X-射线剂量1 Gy,剂量率1Gy/min对NOD-SCID-IL2Rg-/-(NSI)照射后进行CD34造血干细胞骨髓移植，每只小鼠注射5X10^5个细胞。实验共分7组，分别为：niPSCs-1组（n=3），niPSCs-2组（n=4），piPSCs组（n=5），ciPSCs组（n=5），hESCs组（n=4），脐带血组（umbilical cord blood, UCB）（n=3）和阴性对照组（n=4）。　　4.0-5周，每周对小鼠进行血常规检测。　　5.0-10周，每周对小鼠进行CD71、CD3、CD45和CD235a进行流式检测，每间隔一周对 CD43、CD31、CD8等流式标志物检测。　　6.第10周时对小鼠进行解剖，流式检测骨髓（分别检测左右腿股骨）的CD43、CD31、CD71、CD3、CD34、CD45、CD235a;人SRY基因检测；并对肝肺肾及骨髓进行病理检测。　　7.对小鼠的外周血进行人HBB珠蛋白检测：小鼠外周血进行CD235a与β珠蛋白流式检测；先对小鼠外周血进行CD235a标记物分选，再把分选出的细胞进行Western blot检测β珠蛋白。　　结果：　　1.利用CRISPR/Cas9基因修复后的β-地贫iPSCs保持正常核型、多能性标记，能形成畸胎瘤及向造血干细胞分化。　　2.正常人皮肤来源的 iPSCs（ niPSCs-1）、正常人血液来源的 iPSCs（niPSCs-2）、纯合突变的β-地贫 iPSCs（piPSCs）、纯合突变修复后的 iPSCs（ciPSCs）和hESCs通过OP9共培养的方法都能进行造血分化；正常人血液来源的iPSCs比正常人皮肤来源的iPSCs的造血分化CD34阳性效率高。　　3. X-射线半致死量照射后的NSI小鼠第一周时HB（血红蛋白）含量比未照射时（0周）下降，其余各项指标未见明显差异；第二周时，血常规中的HB含量的比较示：niPSCs-1、niPSCs-2、ciPSCs、hESCs、UBC组血红蛋白含量比piPSCs及正常对照组高,但未见明显差异，其余各项指标未见明显差异；而第三周后上述各组间HB含量比较未见明显差异。niPSCs-1与niPSCs-2组各周血常规参数进行相比较，均未见明显差异。　　4.每周对小鼠进行CD71、CD3、CD45和CD235a，每间隔一周对 CD43、CD31、CD8等流式标志物检测示处理组niPSCs-1、niPSCs-2、ciPSCs、hESCs、UBC、piPSCs各组均可检测。niPSCs-1与niPSCs-2组各周进行上述标志物相比较，均未见明显差异。　　5.第10周时对小鼠进行解剖，流式检测骨髓（分别检测左右腿股骨）CD43、CD31、CD71、CD3、CD8、CD45、CD235a等标志物进行流式检测示处理组niPSCs-1、niPSCs-2、ciPSCs、hESCs、UBC、piPSCs各组均可检测，niPSCs-1与niPSCs-2组各周进行上述标志物相比较，均未见明显差异。　　6.第10周时对小鼠进行解剖，各组小鼠的肝肺肾及骨髓进行病理检测均未见明显异常或肿瘤形成。　　7. iPSCs分化的造血干细胞可以在小鼠体内存活并且分化表达β珠蛋白：小鼠外周血进行CD235a与β珠蛋白流式检测结果示：ciPSCs组高于piPSCs组（P<0.01）；niPSCs-1与niPSCs-2组未见明显差异。小鼠外周血分选出的CD235a+细胞进行Western blot检测, ciPSCs组高于piPSCs组β珠蛋白表达。　　结论：　　1.利用CRISPR/Cas9基因修复后的β-地贫iPSCs保留干细胞特性，不影响干细胞的后续研究。　　2.血液来源的iPSCs比皮肤来源的iPSCs在体外具有更高的分化效率；但是在小鼠体内未见明显差异；在肿瘤形成方面也未见差异。　　3. UCB、修复前后的β-地贫iPSCs、hESCs造血分化后的造血干细胞在小鼠体内均能存活及分化为红细胞。　　4. UCB、修复前后的β-地贫iPSCs、hESCs造血分化后的造血干细胞在小鼠体内均没有形成肿瘤，具有安全性。　　5.修复后的β-地贫iPSCs造血干细胞在小鼠体内可以表达β珠蛋白。　　第二部分利用CRISPR/Cas9系统建立β-地贫兔疾病模型　　目的：目前，缺乏一种有效的评价β-地贫等血液疾病iPSCs分化的造血干细胞在体内研究的动物模型。因此本部分旨在探讨利用CRISPR/Cas9系统结合胚胎显微注射技术建立β-地贫兔疾病模型，为研究基因修复后β-地贫病人来源iPSCs分化的造血干细胞移植治疗β-地贫的安全性和有效性评估提供理想的动物模型。　　方法：针对兔Hbb基因第二外显子设计gRNA靶位点，将Cas9和gRNAs体外转录为mRNA显微注射入兔受精卵，移植代孕母兔后可获得Hbb基因敲除的β-地中海贫血家兔模型，对其进行基因型检测以及贫血表型评估。　　结果：体外胚胎注射Cas9（200ng）、gRNA1（20ng）、gRNA2（20ng）对gRNAs活性进行检测，共注射30个受精卵，其中16个发育至囊胚，9个测序成功，经检测全部发生敲除，证明gRNA切割效率较高。将Cas9、gRNAs以相同的浓度注射入30个受精卵移植假孕母兔，在移植的10只母兔中，仅有3只怀孕并且全部流产，推测其原因是 gRNA活性太高导致 Hbb基因双敲致死。然后将Cas9（100ng）、gRNA1（10ng）、gRNA2（10ng）降低浓度注射入受精卵，移植后成功获得两只存活的Hbb基因敲除嵌合体家兔。兔子的血常规及血涂片结果显示小细胞低色素贫血特征。　　结论：利用 CRISPR/Cas9技术结合胚胎显微注射方法可以获得 Hbb基因敲除的β-地贫家兔模型，对于血液类疾病的治疗和研究具有重要的应用价值。